目的:采用高通量测序检测卵巢子宫内膜异位症微小RNA(microRNA，miRNA)及mRNA的表达，分析miRNA-mRNA调控网络关系，探索卵巢子宫内膜异位症的发生机制。方法:回顾性分析2017年3月至2018年3月在中南大学湘雅医院因卵巢子宫内膜异位症行手术的患者20例，取异位内膜及配对在位内膜组织，提取总RNA，分别进行miRNA测序及mRNA测序，获得差异miRNA及mRNA表达谱。运用Targetscan、miRDB数据库预测差异miRNA可能结合的mRNA，并与差异mRNA取交集，获得候选mRNA，采用Cytoscape软件进行miRNA-mRNA调控网络分析，采用DAVID数据库进行基因功能富集(GO)分析和信号通路(pathway)分析。结果:与在位内膜比较，异位内膜差异表达的miRNA有369个(197个上调，172个下调)，差异表达的mRNA 3 765个(1 975个上调，1 790个下调)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)证实miR-202-5p、miR-514a-5p在异位内膜表达高于在位内膜( P<0.05)，而miR-375-3p、miR-449b-5p在异位内膜表达低于在位内膜( P<0.05)，与测序结果相符合。生物信息学发现与这4个miRNA相关的候选mRNA主要富集于核内甾体激素受体结合、跨膜受体及蛋白激酶激活等生物学过程。KEGG通路富集显示其参与了多种信号通路，如TGFβ信号通路、细胞黏附分子信号通路、Wnt信号通路、Rap1信号通路。 结论:miRNA及mRNA在子宫内膜异位症差异表达，二者相互作用通过多种通路参与子宫内膜异位症的发生发展。

目的:探讨微小RNA miR-369-3p靶向调控α-辅肌动蛋白4(ACTN4)表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot法分别检测肝癌及癌旁组织中miR-369-3p、ACTN4的表达水平。采用脂质体法将miR-369-3p mimics、miR-NC、si-ACTN4、si-NC转染至肝癌MHCC97H细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，双荧光素酶报告实验验证miR-369-3p对ACTN4的靶向调控作用，Western blot法检测细胞周期蛋白1(cyclin D1)、p21、B淋巴细胞瘤2 (Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)的表达。结果:肝癌组织中miR-369-3p mRNA的表达水平为0.46±0.04，低于癌旁组织(1.00±0.08, P<0.001)；ACTN4 mRNA的表达水平为3.12±0.29，高于癌旁组织(1.01±0.09, P<0.001)；ACTN4蛋白的表达水平为0.61±0.06，高于癌旁组织(0.25±0.03， P<0.001)。与miR-NC组细胞比较，miR-369-3p过表达肝癌MHCC97H细胞增殖能力降低(细胞培养72 h吸光度分别为0.71±0.06和1.26±0.11， P<0.001)，G 1期细胞比例升高[分别为(51.56±5.23)%和(31.14±3.36)%， P<0.001]，S期细胞比例降低[分别为(14.33±1.45)%和(32.44±3.56)%， P<0.001)]，细胞凋亡率升高[分别为(20.16±2.11)%和(6.25±0.64)% , P<0.001]，cyclin D1和Bcl-2蛋白相对表达量降低(均 P<0.001)，p21和Bax蛋白相对表达量升高(均 P<0.001)。与si-NC组比较，抑制ACTN4的表达后，肝癌MHCC97H细胞增殖能力降低(细胞培养72 h吸光度分别为0.78±0.07和1.24±0.12， P<0.001)，G 1期细胞比例升高[分别为(48.69±4.21)%和(30.33±3.01)%， P<0.001]，S期细胞比例降低[(分别为18.54±1.61)%和(36.21±3.42)%， P<0.001]，细胞凋亡率升高[分别为(18.32±1.82)%和(6.58±0.66)%， P<0.001]，cyclin D1和Bcl-2蛋白水平降低(均 P<0.001)，p21和Bax蛋白水平升高(均 P<0.001)。与miR-369-3p+pcDNA组比较，过表达ACTN4后，肝癌MHCC97H细胞增殖能力提高(细胞培养72 h吸光度分别为1.12±0.11和0.68±0.06， P<0.001)，G 1期细胞比例显著降低[(38.81±3.24)%和(51.80±4.57)%， P<0.001]，S期细胞比例显著升高[(31.65±3.11)%和(15.69±1.44)%， P<0.001]，细胞凋亡率降低[分别为(13.86±1.37)%和(22.69±2.24)%, P<0.001]，cyclin D1和Bcl-2蛋白相对表达量升高(均 P<0.001)，p21和Bax蛋白相对表达量降低(均 P<0.001)。 结论:miR-369-3p可通过靶向调控ACTN4的表达使肝癌细胞周期阻滞于G 1期，抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡。

本研究旨在探讨微小RNA(miRNA,miR)-136-5p对甲状腺癌TPC-1细胞迁移与侵袭能力的影响及其机制.一、材料与方法1.慢病毒过表达载体的转染:在GV369慢病毒载体基础上构建LV-hsa-miR-136重组载体,进一步行慢病毒的包装及浓缩,获得病毒颗粒.实验分为3组:空白对照组、阴性对照组及实验组.胰酶消化TPC-1细胞,接种于培养板中培养24 h,加入5μl含聚凝胺的病毒稀释液进行感染.

目的 探讨白藜芦醇对人恶性脑胶质瘤模型裸鼠体内肿瘤生长的影响及其机制.方法 选取4周龄BALB/c雌性裸鼠10只,按随机数字表法分为白藜芦醇组和对照组,每组5只.两组均采用皮下移植成瘤法在裸鼠右前肢前臂皮下接种人恶性脑胶质瘤U251细胞悬液,建立裸鼠恶性脑胶质瘤模型.肿瘤种植后第10天,裸鼠右前肢皮下明显触及肿块,提示造模成功;白藜芦醇组裸鼠用浓度为50 mmol/L白藜芦醇溶液200 μL灌胃,对照组裸鼠以等量等浓度二甲基亚砜生理盐水灌胃,每3日给药1次,共用药7次.第1次用药前记录肿瘤的最长径、最短径,计算肿瘤体积.每次给药后第3天测量肿瘤大小.完成最后一次测量后处死动物,完整取出瘤块.采用Western blot法检测白藜芦醇组和对照组肿瘤组织标本中FOXP2蛋白的表达,实时荧光定量PCR( qPCR)测定miR-9的表达.结果 白藜芦醇组和对照组均成功建立恶性脑胶质瘤移植瘤动物模型.皮下接种肿瘤细胞第10天白藜芦醇组肿瘤体积(12. 94 ± 10. 17)mm3 ,对照组肿瘤体积(6. 46 ± 2. 67) mm3 .第1、2、3、4次给药后,白藜芦醇组肿瘤体积分别为( 25. 58 ± 16. 41 ) mm3 、 ( 32. 33 ± 17. 62 ) mm3 、 ( 58. 81 ± 7. 66)mm3 、(97. 67 ± 20. 76)mm3 ,对照组肿瘤体积分别为(12. 02 ± 8. 71) mm3、(30. 73 ± 15. 74) mm3 、(52. 88 ± 20. 03)mm3 、(88. 50 ± 37. 01)mm3,白藜芦醇组肿瘤体积均大于对照组,但差异均无统计学意义(P 值均 >0. 05);第5、6、7 次给药后,白藜芦醇组肿瘤体积分别为(114. 94 ± 29. 35) mm3 、(237. 42 ± 23. 3)mm3 和(231. 27 ± 12. 6) mm3,均小于对照组的(191. 71 ± 53. 79) mm3 、(314. 67 ± 24. 4)mm3和(374. 03 ± 21. 6)mm3,两组比较差异均有统计学意义( t= -2. 802、-5. 114、-6. 320, P值均<0. 01).白藜芦醇组FOXP2蛋白相对表达量为100. 60 ± 41. 75,低于对照组的165. 51 ± 16. 31, miR-9相对表达量为0. 971 ± 0. 369,高于对照组的0. 496 ± 0. 008,差异均有统计学意义( t=3. 238、2. 878, P值均<0. 05).结论 白藜芦醇能抑制恶性脑胶质瘤模型裸鼠体内肿瘤的生长,其机制可能是通过调节miR-9和FOXP2的表达实现.

目的 探讨过表达miR-155对强直性脊柱炎滑膜细胞凋亡的影响及作用机制.方法 选择2018年5—7月四川省遂宁市中心医院风湿免疫科收治的强直性脊柱炎患者,取其滑膜细胞进行试验.构建miR-155慢病毒表达载体,并在293 T细胞中获得重组慢病毒,经感染NP细胞得到稳定过表达细胞系GV369-miR-155-NP(GV369-miR-155-NP组),同时设置空载体GV369-NP组和空白组.荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白GFP的表达,RT-qPCR方法检测miR-155的表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡,荧光素酶报告基因分析验证miR-155与FasL的靶向关系,Western-blot法检测细胞中凋亡相关蛋白FADD、Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达,试剂盒检测细胞线粒体膜电位的变化情况.结果 在荧光显微镜下观察,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白组细胞未见绿色荧光.与空白组比较,GV369-miR-155-NP组中miR-155、Bcl-2表达水平和线粒体膜电位明显升高,而细胞凋亡率、FADD、Caspase-3和Bax的表达水平均明显下降,差异均有统计学意义(t/P=12.399/0.000、8.658/0.000、4.879/0.002、12.612/0.000、8.450/0.000、7.711/0.000、6.977/0.001);GV369-NP组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05).荧光素酶报告基因分析证实miR-155与FasL存在靶向关系.结论 miR-155可抑制强直性脊柱炎滑膜细胞发生凋亡,既可通过靶向调控外源性FasL/Fas通路参与Caspase-3和FADD介导的细胞凋亡,也可通过线粒体途径对细胞凋亡发挥作用.

目的 分析血清miR-27与老年2 型糖尿病下肢血管病变及25(OH) D3 水平的关系.方法 选取2017年10月—2019年5月河北省沧州市人民医院内分泌科确诊老年2型糖尿病患者86例为T2DM组,并以有无下肢血管病变分为下肢血管病变 (LLPAD)亚组44例和非下肢血管病变( Non-LLPAD) 亚组42例;选择同期医院门诊健康体检者76例为对照组,测定比较各组血清miR-27 mRNA表达及TC、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c、FPG、25(OH)D3 、hs-CRP、Fib水平.结果 T2DM组miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平高于对照组,25( OH) D3 、HDL-C水平低于对照组( t =13. 371、13. 036、25. 364、19. 698、29. 326、38. 489、95. 524、66. 547,66. 241、8. 698, P均=0. 000);LLPAD 亚组 miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、 HbA1c、 hs-CRP、 FPG 水平高于 Non-LLPAD 亚组,25 (OH)D3 、HDL-C水平低于Non-LLPAD亚组(t=5. 275、13. 541、26. 541、8. 965、20. 146、14. 548、14. 369、23. 654、7. 711、9. 491,P均=0. 000);miR-27 mRNA与25(OH)D3 、HDL-C呈负相关(r= -0. 486、-0. 483,P=0. 039、0. 039),与TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG呈正相关(r=0. 651、0. 572、0. 494、0. 747、0. 438、0. 523、0. 591,P均＜0. 05);高水平的miR-27 mRNA、TC及低水平的25(OH)D3 均为老年2型糖尿病合并下肢血管病变发生的危险因素(OR=2. 437、4. 268、13. 625,P＜0. 05);miR-27 mRNA、25(OH)D3 两者的AUC相近,均小于TC;miR-27 mRNA、25( OH) D3 诊断老年2型糖尿病下肢血管病变的敏感度、特异度相近(P＞0. 05),均小于TC(P＜0. 05).结论 老年2型糖尿病下肢血管病变患者血清miR-27 mRNA水平升高,与25(OH)D3 呈负相关;miR-27、25(OH)D3 诊断2型糖尿病下肢血管病变具有较高的敏感度、特异度,可作为判定2型糖尿病下肢血管病变的生物学标志物.

目的 筛选子宫内膜样腺癌(EEC)组织中差异表达的miRNA,并分析其与患者预后高危因素的关系.方法 收集手术治疗的79例EEC患者的临床病理资料,获得冰冻EEC组织和邻近正常子宫内膜组织.使用IllumiR?NA HiSeq 2000芯片筛选3对样品中差异表达的miRNA分子,利用qRT-PCR在17对样品中验证芯片筛选的异常变化的miRNA表达,并且在59对样品中进一步检测变化最为明显的miRNA的相对表达量.根据手术病理分期、组织分化程度、淋巴结转移和脉管间隙浸润等临床病理参数,进一步分析变化最为明显的miRNA表达水平与EEC患者预后的关系.结果 芯片结果提示,3对冰冻EEC组织和邻近正常子宫内膜组织存在40个显著差异表达的miR?NA,8个具有代表性(5个下调的miRNA分别为hsa-miR-369-3p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-451a、hsa-miR-493-5p和hsa-miR-543,3个上调的miRNA分别为hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-143-3p和hsa-miR-145-5p).qRT-PCR验证结果显示,与邻近正常子宫内膜组织相比,EEC组织中hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-145-5p的表达差异倍数分别为6.50±0.09、2.70±0.16、5.60±0.22,hsa-miR-369-3p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-451a、hsa-miR-493-5p、hsa-miR-543表达差异倍数分别为0.133±0.012、0.268±0.020、0.372±0.009、0.179±0.011、0.222±0.014,验证结果和芯片结果趋势一致,hsa-miR-369-3p下调最为明显.59对冰冻EEC组织和邻近正常子宫内膜组织中hsa-miR-369-3p的相对表达量分别为0.233±0.175、1,两者比较P<0.05.EEC组织中hsa-miR-369-3p的表达与患者不同手术病理分期、组织分化程度、有无淋巴结转移和脉管间隙浸润有关(P均<0.05).结论 利用芯片技术及qRT-PCR技术筛选出了EEC中差异表达的miRNA;hsa-miR-369-3p的表达与EEC患者预后高危因素有关,可能成为EEC患者预后评价的指标.

目的 探讨微小RNA-1269a(miR-1269a)对肝癌细胞侵袭、迁移和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响及可能机制.方法 采用Ualcan数据库分析肝癌组织中miR-1269a的水平;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测人正常肝细胞HL-7702和人肝癌细胞(Huh-7、HCCLM6、Hep3B和SMMC-7721)的miR-1269a水平.将SMMC-7721细胞分为4组:空白对照组、阴性对照组、抑制物(Inhibitor)组(转染miR-1269a inhibitor)和Inhibitor+LY294002组(转染miR-1269a inhibitor+PI3K抑制剂LY294002),MTT法、划痕实验和Transwell小室实验检测细胞增殖活力、划痕愈合率和穿膜细胞数,Western blotting检测PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt1和磷酸化Akt1(p-Akt1)水平,在线预测miR-1269a与靶基因第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白(PTEN)的潜在结合序列并经荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系.结果 369例原发性肝癌组织的miR-1269a水平高于49例正常肝组织(P<0.05).肝癌细胞的miR-1269a水平均高于HL-7702细胞(P<0.05).与空白对照组和阴性对照组相比,Inhibitor组的增殖活力减弱且p-PI3K和p-Akt1水平降低(P<0.05);空白对照组、阴性对照组、Inhibitor组和Inhibitor+LY294002组的划痕愈合率依次为(70.235±3.484)％、(75.269±6.245)％、(44.376±3.174)％和(21.812±0.968)％,穿膜细胞数依次为(192.453±10.324)、(201.288±5.873)、(129.197±8.485)和(47.839±9.037)个,Inhibitor组的划痕愈合率和穿膜细胞数均少于空白对照组和阴性对照组(P<0.05).空白对照组和阴性对照组上述指标的差异无统计学意义(P>0.05),而Inhibitor+LY294002组的上述指标均低于Inhibitor组(P<0.05).PTEN野生型载体和miR-1269a模拟物共转染细胞的荧光素酶活性较PTEN突变型载体和miR-1269a模拟物共转染细胞降低(P<0.05).结论 miR-1269a在肝癌组织和细胞中高表达,且可能通过靶向PTEN来激活PI3K/Akt信号通路来促进肝癌细胞的迁移和侵袭,miR-1269a可能通过调控PI3K/Akt/PTEN轴来发挥促癌作用.

目的 探讨微小RNA-1258(miR-1258)调控Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)通路对肝癌SMMC-7721细胞增殖、侵袭和迁移的影响.方法 基于Ualcan数据库分析肝癌组织的miR-1258水平.将SMMC-7721细胞分为4组:空白对照组、阴性对照组、miR-1258模拟物(miR-1258-M)组(转染miR-1258 mimics)和miR-1258-M+SKL2001组(转染miR-1258 mimics和Wnt/β-catenin通路激动剂SKL2001),采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-1258水平,CCK-8实验、划痕实验和Transwell小室实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力,qPCR和Western blotting检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白Wnt7b、β-cate-nin、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)和基质金属蛋白酶(MMP)-9的水平,双荧光素酶报告系统验证miR-1258与Wnt7b间的靶向关系.结果 Ualcan数据库分析显示369例原发肝癌组织的miR-1258中位水平为0.156,低于49例正常肝组织的14.113(P<0.05).与空白对照组和阴性对照组比较,miR-1258-M组转染48、72 h时的增殖活力降低(P<0.05),而miR-1258-M+SKL2001组的增殖活力较miR-1258-M组升高(P<0.05).miR-1258-M组的划痕愈合率为(18.774±0.462)％,低于空白对照组的(77.597±2.535)％、阴性对照组的(73.576±1.921)％和miR-1258-M+SKL2001组的(69.349±3.136)％(P<0.05),穿膜细胞数为(101.425±4.631)个,少于空白对照组的(144.876±4.807)个、阴性对照组的(165.532±15.235)个和miR-1258-M+SKL2001组的(152.026±3.172)个(P<0.05).与其余三组相比,MiR-1258-M组的Wnt7b、β-catenin和MMP-9水平降低,而p-GSK-3β 水平升高,差异有统计学意义(P<0.05).空白对照组、阴性对照组和miR-1258-M+SKL2001组上述指标的差异无统计学意义(P>0.05).MiR-1258 mimics明显降低野生型Wnt7b转染细胞的荧光素酶活性(P<0.05),而对突变型Wnt7b转染细胞的荧光素酶活性影响无统计学意义(P>0.05).结论 miR-1258在肝癌中发挥抑癌作用且可能通过抑制Wnt/β-catenin信号抑制肝癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,可作为肝癌治疗的潜在靶点.

目的:探讨微小RNA-369-3p(miR-369-3p)是否通过靶向胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)影响宫颈癌细胞顺铂(DDP)耐药性.方法:体外培养人宫颈癌细胞HeLa,采用顺铂梯度暴露法构建顺铂耐药宫颈癌细胞株HeLa/DDP;实验分组:DDP+miR-NC组、DDP+miR-369-3p组、DDP+si-NC组、DDP+si-CTHRC1组、DDP+miR-369-3p+pcDNA组、DDP+miR-369-3p+pcDNA-CTHRC1组;采用MTT法检测细胞增殖抑制率及计算IC50值;qRT-PCR检测miR-369-3p、CTHRC1表达量;Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭;双荧光素酶报告实验验证miR-369-3p、CTHRC1的靶向关系;Western blot检测CTHRC1、Cy-clinD1、MMP-2、MMP-9、p21表达.结果:与HeLa组比较,HeLa/DDP组细胞增殖抑制率、miR-369-3p的表达水平显著降低(P<0.05),IC50值、CTHRC1 mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05);HeLa/DDP细胞转染miR-369-3p mimics或转染si-CTHRC1后,细胞增殖抑制率、p21蛋白水平显著升高(P<0.05),迁移细胞数、侵袭细胞数显著减少(P<0.05),CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-369-3p可靶向结合CTHRC1;CTHRC1过表达可明显逆转miR-369-3p过表达对细胞增殖、迁移、侵袭及顺铂耐药性的作用.结论:miR-369-3p过表达可能通过下调CTHRC1表达抑制HeLa/DDP细胞增殖、迁移及侵袭从而逆转宫颈癌细胞顺铂耐药性.