目的:比较甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)四种核酸检测方法。方法:采用A、B、C实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)及D微滴芯片数字RT-PCR(RT-dPCR)分别对HAV质粒标准品、梯度稀释的HAV疫苗进行灵敏度检测；对相关病毒核酸进行特异性检测；用A、B、C方法对40份人工污染HAV牡蛎、市售牡蛎及血清标本、HAV疫苗标本进行检测，比较检出率；比较A、D方法对低浓度HAV人工污染牡蛎的回收率。结果:A、B方法对质粒标准品均可检测至10拷贝/μL；检测梯度稀释的HAV疫苗，A、B、C方法的斜率、R 2值、扩增效率(-3.446～-3.297、0.991～0.998、95.07%～101.051%)均在可接受范围；40份不同来源的标本，A、B、C方法的阳性检出率分别是50%(20/40)、47.5%(19/40)、55%(22/40)，差异无统计学意义( χ2＝0.467， P＝0.792)；A、D方法对梯度稀释疫苗检测灵敏度无明显差别，对低浓度HAV人工污染牡蛎检测，D方法回收率高于A方法，但差异无统计学意义(F＝0.294，P＝0.642)。 结论:A、B、C方法无明显差异，较方便快捷；在检测低浓度HAV污染的食品时，D方法略有优势，但检测成本稍高，选取检测方法可根据实际情况选择。

目的:开发用于甲型流感病毒快速分型的Taqman低密度芯片(Taqman low density array，TLDA)，可以同时开展甲型流感病毒通用、H1-H16及N1-N9亚型高通量快速鉴定，适用于流感样病例及禽流感标本中甲型流感病毒的快速分型鉴定。方法:设计甲型流感病毒通用、H1-16亚型、N1-9亚型的引物探针，并将其预先定制在TLDA反应芯片上；优化TLDA退火温度；用多种亚型的甲型流感病毒核酸进行10倍梯度稀释，结合微滴式数字PCR定量方法评价TLDA检测灵敏度；用乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞等其他多种常见的呼吸道病毒验证该TLDA检测特异性，同时选用多种已经明确分型的甲型流感病毒评价该TLDA的特异性和有效性；采集16例流感样病例标本及24例禽流感外环境标本用该芯片开展检测。结果:该TLDA的最佳退火温度为60 ℃；针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N6、H7N9和H9N2，其检测灵敏度为1.52~8.00拷贝/μl；能特异性检测甲型流感病毒，与其他常见呼吸道病毒无交叉反应，并能精准鉴定多种甲型流感病毒的亚型；应用该方法检测16例流感样病例标本和24例禽流感外环境监测标本，均可分型。结论:基于TLDA技术建立的甲型流感病毒高通量快速分型检测方法具有较好的灵敏度和特异性，适用于流感样病例和禽流感标本的病原快速检测，特别是对目前用常规商业化试剂尚无法鉴定的新型甲型流感病毒能够进行快速的亚型筛查与鉴定。

微小残留病(MRD)是急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿最重要的预后指标。不同时间点的MRD检测结果，可提供不同临床信息。早期治疗阶段的MRD检测结果，可以反映ALL患儿的综合化疗效果，是其危险度分级的重要参考依据。目前，常用的MRD检测技术包括实时定量聚合酶链式反应技术(RQ-PCR)、多参数流式细胞术(MFC)、荧光原位杂交技术(FISH)和新技术。其中，RQ-PCR检测MRD的灵敏度较FCM高，但更为费时。临床应用中，应根据不同治疗目的，选择合适的MRD检测方法。数字微滴PCR(ddPCR)及二代基因测序(NGS)作为MRD检测的最新技术，可进一步提高MRD检测的灵敏度，在早期识别复发高风险的ALL患儿中更具优势。笔者拟就MRD与ALL患儿危险度分层诊疗的关系、MRD检测标本的选择、MRD检测方法及其选择进行阐述。

目的:探讨微滴式数字聚合酶链反应（ddPCR）在检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）中表皮生长因子受体（EGFR）突变的应用价值。方法:收集山西省肿瘤医院2018年8月至2019年3月就诊的63例NSCLC患者外周血标本，采用ddPCR检测患者外周血EGFR敏感突变，并与对应组织扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）检测结果比较。采用Kappa检验对两种检测方法一致性进行分析。结果:63例患者中，ddPCR共检测到EGFR敏感突变31例（49.2%），包括第18号外显子G719X突变1例（1.6%）、第19号外显子缺失（E19-Del）12例（19.0%）、第20号外显子T790M突变（T790M）11例（17.5%）、第21号外显子L858R突变（L858R）7例（11.1%）；31例突变患者中7例（22.6%）为双突变。ARMS-PCR检出上述4种突变26例（41.3%），依次有0例、12例（19.0%）、6例（9.5%）、8例（12.7%）；26例突变患者中双突变5例（19.2%）。1例患者ARMS-PCR检测L858R阳性而ddPCR检测L858R阴性。两种检测方法一致率为90.3%（κ=0.8，P<0.05）。31例ddPCR检测突变患者外周血ctDNA EGFR突变中位丰度1.7%（0.04%~23.60%），其中E19-Del中位丰度为2.5%（0.35%~22.70%），T790M突变中位丰度为0.6%（0.04%~14.00%），L858R突变中位丰度为2.3%（0.20%~23.60%）；ddPCR检测EGFR基因突变丰度<1%者10例，占所有突变者的32.6%（10/31），ARMS-PCR仅检出其中5例。接受酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗且发生获得性耐药的19例患者中，ddPCR检出T790M突变11例（57.9%），而无TKI用药史患者均未检测出此突变。11例T790M突变患者中，突变丰度<0.1%者1例，0.1%~2.0%者7例，>2.0%者3例。结论:ddPCR检测NSCLC患者外周血ctDNA中EGFR基因突变无创、快捷、灵敏度高且可绝对定量，为取样困难或因获得性耐药需重复取样肺癌患者进行EGFR-TKI靶向治疗提供了一个新的检测途径，个体化靶向治疗提供重要依据。

目的:构建一种重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)病毒颗粒数微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)检测方法。方法:以新型冠状病毒BA.1株基因组为靶基因，选取刺突蛋白保守序列设计引物和探针，建立重组新型冠状病毒疫苗病毒颗粒数ddPCR方法，并进行线性、准确度、专属性、重复性和耐用性等方法学验证。结果:ddPCR的最佳退火温度是63℃，病毒颗粒数为5×10 5~2×10 7 VP/ml时，线性和回收率良好，探针和引物特异性好，重复性和中间精密度变异系数(coefficient of variation，CV)都在10%以内，耐用性CV值在15%以内，并且与qPCR结果相比，CV值都在10%以内。 结论:本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、稳定性好、特异性强，可用于重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)病毒颗粒数的定量检测。

目的:探索BRAF V600E突变比值（The Ratio of BRAF V600E expression），在预测甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）颈部淋巴结转移（lymph node metastasis，LNM）中的临床价值。 方法:收集于浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院2018年1月至2019年1月间手术治疗的234例PTC患者，采用微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）定量法检测病理石蜡标本BRAF V600E突变比值，分析突变比值与PTC患者LNM的相关性，构建受试者工作特征曲线（ROC）。 结果:PTC患者伴有LNM者的BRAF V600E突变比值显著高于无LNM者（ P<0.01），ROC曲线显示BRAF V600E突变比值预测LNM的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和曲线下面积（AUC）分别为27.7%、91.0%、73.3%、58.5%、0.581。 结论:利用PTC病理石蜡标本中BRAF V600E突变比值预测LNM有较高的特异性，可为PTC颈淋巴结清扫提供临床决策。

目的:基于下一代测序技术（NGS）检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆循环游离DNA（cfDNA）突变的性能验证，评估NGS、微滴式数字PCR（ddPCR）和超级扩增阻滞突变系统（super-ARMS）在NSCLC患者中的应用。方法:入组75例于复旦大学附属中山医院呼吸科就诊的NSCLC患者。采用NGS检测标准品、25例初诊未治疗患者的血浆cfDNA、以及血浆中掺入血红蛋白（0.5 mg）、胆红素（0.5 mg）、脂肪乳（0.5 mg）、肠球菌基因组DNA（gDNA）和大肠埃希菌gDNA的自制混合标本，以验证NGS平台的空白限、分析灵敏度、精密度、准确性及分析特异性。采用ddPCR和NGS检测75例NSCLC患者的cfDNA突变，比较两平台的突变阳性率，采用Pearson相关性检验比较两平台对于cfDNA突变丰度之间的线性关系。在75例患者中采用简单随机抽样法抽取12例进行血浆super-ARMS平台的检测，比较NGS、ddPCR与super-ARMS的检测一致性。结果:NGS平台对血浆cfDNA突变检测的空白限为0.00%；敏感度为0.2%；批内精密度、批间精密度均为100%；准确性为100%；检测结果不受血浆内源性血红蛋白、胆红素、甘油三酯或外源性DNA干扰影响，分析特异性好。75例NSCLC患者血浆cfDNA 的ddPCR平台和NGS平台的突变阳性率分别为61.33%、60.00%，完全一致率为89.33%。NGS与ddPCR均检测出突变的51个位点的突变丰度呈正相关（ r=0.984， P=0.001）。在简单随机抽样法抽取的12例NSCLC患者血浆中，NGS、ddPCR与super-ARMS三平台检测结果完全一致的共7例，包括2例野生型，5例突变型。 结论:NGS平台经验证可用于NSCLC患者cfDNA突变检测，ddPCR、NGS、super-ARMS对血浆cfDNA的突变检测各有优势。

目的:应用微滴式数字化(droplet digital)PCR方法检测McCune-Albright综合征(MAS)患儿GNAS已知热点突变，并探讨其在MAS诊断中的应用价值。方法:研究对象为122名就诊于上海交通大学医学院附属瑞金医院儿科的MAS患儿，针对MAS致病基因GNAS的已知突变热点(R201H/C)，分别采用ddPCR技术、实时荧光焦磷酸解激活聚合反应技术(PAP)及二代测序方法检测其是否存在基因突变，并结合临床进行关联分析。结果:122例MAS患儿中共89例完善了GNAS基因检测，发现存在突变者共57例。ddPCR、PAP及二代测序阳性率分别为77.42%、29.03%及56.25%。完善检测的经典三联征患者均检测出GNAS基因突变。其中，ddPCR方法在典型及不典型患儿外周血中阳性率分别为100%及73.1%，明显高于其余两种方法。性早熟合并骨病变患者GNAS突变检出率高于性早熟合并皮肤病变者，提示骨纤维结构不良伴性早熟是儿童MAS的临床诊断的重要依据。结论:儿童MAS的内分泌表现以性早熟最为多见。骨纤维结构不良伴性早熟是临床诊断的重要权重因素。ddPCR灵敏度高，可为MAS的分子诊断提供帮助。

目的:评估HBV相关性肝病终末期患者接受肝移植治疗后HBV复发的风险，探讨抗病毒治疗停药指征。方法:本研究回顾性分析31例肝移植术后患者肝穿刺组织中的HBV DNA、共价闭合环状DNA（cccDNA）和外周血相关检测资料。结果:31例患者中15例（48%）肝穿组织中可检测并定量HBV DNA，这些患者所有HBV相关血清学指标均为阴性，考虑为隐匿性HBV感染，余16例患者所有的检测指标均阴性。恩替卡韦组共19例，其中15例（78.9%）cccDNA不可测得。拉米夫定组共12例，其中5例（41.6%）cccDNA不可测得，差异有统计学意义（ P=0.03）。 结论:通过微滴式数字PCR扩增肝穿刺组织中cccDNA及HBV DNA可发现隐匿性的HBV感染，可作为患者抗病毒治疗停止与否的辅助生物学标志物；恩替卡韦对cccDNA的清除率显著优于拉米夫定，结合其低耐药率及经济性，是可选择的一线治疗药物。

目的:建立一种用于猴痘病毒(mpox virus)核酸检测的微液滴数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)检测方法。方法:设计靶向猴痘病毒 F3 L基因的特异性引物和探针，建立猴痘病毒核酸的ddPCR检测方法，对ddPCR的最适反应条件进行优化，并对ddPCR的特异性、灵敏度以及重复性进行检测。进一步对人脓拭子临床样本进行检测，对ddPCR方法检测临床样本的能力进行评价。 结果:对ddPCR反应温度和引物探针浓度进行优化，建立猴痘病毒ddPCR检测方法，该方法最低检测限可达2拷贝/μl，与其他8种病毒无交叉反应。对10份人皮肤脓液拭子临床样本中的猴痘病毒进行检测，ddPCR方法检测到5份阳性样本，实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR, qPCR)方法检测到4份阳性样本。结论:建立的猴痘病毒的ddPCR检测方法快速、特异、灵敏度高，用于临床样本中猴痘病毒检测。