[目的]本研究旨在明确花蓟马Frankliniella intonsa化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)FintCSP2与聚集信息素苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯[neryl(S)-2-methylbutanoate]的结合能力.[方法]利用RT-PCR法扩增花蓟马FintCSP2的开放阅读框序列,并对其进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测FintCSP2在花蓟马雌成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹和足)中的表达量;利用RNAi通过向花蓟马雌成虫注射dsRNA沉默FintCSP2,24 h时通过触角电位(electroantennogram,EAG)实验检测花蓟马对苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的反应,利用Y型嗅觉仪测定花蓟马雌成虫对苊肉基(S)-2-甲基丁酸酯的的选择性;原核表达FintCSP2重组蛋白,利用荧光竞争结合实验检测FintCSP2重组蛋白与苊肉基(S)-2-甲基丁酸酯结合力;采用分子对接模拟技术和蛋白定点突变技术分析FintCSP2与苊肉基(S)-2-甲基丁酸酯结合的关键氨基酸残基.[结果]花蓟马FintCSP2(GenBank登录号:MT211602.1)开放阅读框长390 bp,编码129个氨基酸,N端有一个包含20个氨基酸的信号肽,含有4个保守的半胱氨酸.氨基酸序列分析结果表明,FintCSP2氨基酸与花蓟马 CSP1(GenBank 登录号:WBW64307.1)、西花蓟马F.occidentalis CSPs(GenBank登录号:WBW64306.1,AJL33750.1)和牛角花齿蓟马 Odontothrips loti CSP2(GenBank 登录号:WBU77202.1)的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性分别为99.22％,99.22％,86.05％和65.85％.RT-qPCR结果表明,FintCSP2在雌成虫各组织中均有表达,其中在触角中的表达量最高.与对照组(注射dsEGFP)比,沉默FintCSP2显著降低花蓟马对苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的EAG反应绝对值和选择率.分子对接预测Tyr24,Phe29,Leu38,Val71,Cys76,Cys79和Gln83这7个氨基酸残基最可能参与FintCSP2结合苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯;定点突变和荧光竞争结合实验结果表明,与野生型蛋白相比,FintCSP2-Tyr24Ala和FintCSP2-Gln83Ala突变蛋白与苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯结合能力显著下降,FintCSP2-Phe29Ala突变体蛋白失去与苊肉基(S)-2-甲基丁酸酯的结合能力.[结论]花蓟马FintCSP2蛋白在识别苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯过程中起关键作用,Tyr24,Phe29和Gln83是FintCSP2结合苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的3个关键氨基酸残基.

[目的](反,反)-8,10-十二碳二烯-1-醇[(8E,10E)-dodecadien-1-ol,E8,E10-12∶OH]是苹果蠹蛾Cydia pomonella的主要性信息素成分,对梨小食心虫Grapholita molesta性诱剂具有引诱增效作用.本研究旨在测定E8,E10-12∶OH对梨小食心虫性诱剂的增效能力,确定主要结合E8,E10-12∶OH的信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)和普通气味结合蛋白(general odorant binding proteins,GOBPs).[方法]利用触角电位(electroantennogram,EAG)仪测定梨小食心虫雄成虫对 0.002,0.02,0.2,2,20,200 和 2 000 μg E8,E10-12∶OH 激发的 EAG 反应;利用田间诱集试验测定E8,E10-12∶OH对梨小食心虫性诱剂的增效能力;利用荧光竞争结合实验测定梨小食心虫信息素结合蛋白GmolPBP1,GmolPBP2和GmolPBP3及普通气味结合蛋白GmolGOBP1,GmolGOBP2和GmolGOBP3与E8,E10-12∶OH的抑制常数Ki;利用分子动力学模拟的方法预测GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的关键氨基酸;利用定点突变和荧光竞争结合实验验证GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的关键氨基酸残基及弱相互作用力.[结果]梨小食心虫雄成虫对E8,E10-12∶OH表现出EAG反应,雄成虫对2 000 μg E8,E10-12∶OH的EAG反应值最高[(0.57±0.14)mV].在梨小食心虫性诱剂中添加200 μg E8,E10-12∶OH时,增效效果最佳,增效倍数达 2.46 倍.GmolGOBP2 结合 E8,E10-12:OH 的能力最强[Ki=(1.92±0.05)μmol/L],是结合E8,E10-12∶OH的主要OBP.分子动力学模拟表明GmolGOBP2的Phe18,Ile100,Glu104,Val117和Phe124结合 E8,E10-12∶OH 的自由能最低,分别为-1.18,-1.33,-3.34,-1.19 和-1.58 kj/kg,预测是GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的重要位点,将以上5个残基定点突变为丙氨酸Ala后,突变体蛋白E104A和F124A失去了结合E8,E10-12∶OH的能力,表明Glu104和Phe124是GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的关键氨基酸.[结论]E8,E10-12∶OH是开发梨小食心虫高效性诱剂的理想增效剂,GmolGOBP2在梨小食心虫识别种间性信息素E8,E10-12∶OH的过程中发挥着重要作用,Glu104和Phe124是GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的关键氨基酸残基.

[目的]本研究旨在为深入研究梨小食心虫Grapholita molesta尼曼-匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 protein,NPC2)GmolNPC2的嗅觉感受功能提供理论参考.[方法]基于梨小食心虫触角转录组数据,利用RT-PCR扩增GmolNPC2的cDNA全长序列,进行系统进化分析和3D结构模型预测;利用RT-qPCR检测GmolNPC2在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和雌雄成虫)、3日龄雌雄成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足和翅)中的相对表达量;利用荧光竞争结合实验测定重组GmolNPC2蛋白对包括6种性信息素和38种寄主植物挥发化合物在内的44种气味配体的抑制常数Ki 值,分析结合能力;通过分子对接模拟实验计算GmolNPC2与不同气味配体的结合能,预测蛋白和配体相互作用的关键氨基酸残基.[结果]获得梨小食心虫GmolNPC2(GenBanK登录号:OQ054801)的cDNA全长序列,开放阅读框(ORF)长438 bp,编码145个氨基酸;多序列比对发现GmolNPC2具有昆虫NPC2典型的结构特征;系统进化分析表明已知鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的 NPC2s 聚类至 2 个分枝,GmolNPC2 与大豆食心虫 Leguminivora glycinivorella、红铃虫Pectinophora gossypiella和烟草天蛾Manduca sexta等的NPC2氨基酸序列一致性较高并聚类至同一分枝.RT-qPCR检测结果表明,GmolNPC2在梨小食心虫雄成虫和卵中的表达量显著高于其他发育阶段的;GmolNPC2在3日龄雌雄成虫翅中的表达量最高,在触角中的次之,在胸、腹和足中的最低.重组蛋白GmolNPC2的结合谱较窄,仅能够结合44种气味配体中的17种,对其中的乙酸-顺-8-十二碳烯酯、苯甲醇和乙酸-顺-3-己烯酯表现出强烈的结合能力,Ki 值分别为(4.117± 0.046),(4.845±0.079)和(3.979±0.167)μmol/L.分子对接模拟结果显示,GmolNPC2 与不同气味配体之间的结合能存在差异,与上述荧光结合实验的结果较一致.疏水性氨基酸残基和氢键在GmolNPC2结合不同气味配体中发挥着重要作用.[结论]GmolNPC2具有昆虫NPC2家族的保守结构,在卵和成虫以及成虫翅和触角中的表达量较高,推测其参与梨小食心虫的多种生理过程.重组蛋白GmolNPC2能够选择性地结合性信息素和寄主植物挥发化合物,表明GmolNPC2参与对挥发性信息物质的识别和运输.

[目的]筛选特定条件下桃蛀螟Conogethes punctiferails稳定表达的内参基因,为桃蛀螟基因定量研究奠定基础.[方法]参考文献报道,并根据桃蛀螟转录组测序结果筛选出β-肌动蛋白基因ACT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、核糖体蛋白49基因RP49、α-微管蛋白基因α-tub、核糖体蛋白L13基因RPL13和液泡型ATP合酶基因V-A TPase等6个候选基因.再利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定6个候选基因在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中的表达量;然后通过ACt法,GeNorm,NormFinder,BestKeeper和RefFinder 5个软件对6个候选基因的稳定性进行评估;最后以桃蛀螟嗅觉受体基因(olfactory receptor co-receptor,Orco)和性信息素结合蛋白基因(pheromone binding protein1,PBP1)为目的基因,验证6个候选基因分别在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中的的稳定性.[结果]△Ct法,GeNorm,NormFinder和BestKeeper分析结果表明,4个软件对6个候选基因稳定性的排序相似,在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中稳定性较高的3个基因为RP49,RPL 13和GAPDH;同时4个软件均判定ACT的稳定性最低.进一步利用RefFinder进行综合分析,结果显示,在桃蛀螟成虫不同组织中,最稳定的基因为RPL 13,其次为RP49;而在不同发育时期,最稳定的基因为RP49,其次为GAPDH.另外经GeNorm软件计算得出,在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中桃蛀螟内参基因的最佳数目为2.最后,以嗅觉受体基因Orco和PBP1为目的基因,对筛选出的候选基因的稳定性进行验证,发现当使用RPL13和RP49以及RP49和GAPDH作为内参基因时,Orco及PBP1的表达量规律一致,并与桃蛀螟生活习性及前人研究结果一致;而使用ACT作为内参基因计算得到的Orco和PBP1表达量则不规律.[结论]在不同发育时期桃蛀螟基因定量研究中建议以RP49和GAPDH作为内参基因,而在桃蛀螟成虫不同组织中基因定量研究中建议以RPL13和RP49作为内参基因.

[目的]气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)有助于提高昆虫嗅觉系统的敏感性,并且在蚜虫报警信息素反-β-法尼烯[(E)-β-famesene EBF]的通信过程中起重要作用.萝卜蚜Lipaphis erysimi是十字花科作物的主要害虫,为了减少蔬菜田间的农药使用,EBF对蚜虫防治具有很大的潜力.然而,目前萝卜蚜对EBF反应的研究甚少.[方法]本研究利用PCR和RACE技术克隆并鉴定了2种公认的在萝卜蚜中对EBF具有高度亲和力的气味结合蛋白的基因LeryOBP3和LeryOBP7;利用RT-qPCR检测了它们在萝卜蚜不同发育阶段和无翅成蚜不同组织中的表达谱.[结果]克隆获得的萝卜蚜2个基因序列LeryOBP3(GenBank登录号:KJ703012)和LeryOBP7(GenBank登录号:KJ703013)分别与豌豆蚜Acyrthosiphum pisum ApisOBP3和ApisOBP7序列对比有较高的氨基酸序列一致性(分别为94％和88％),基因序列符合气味结合蛋白基因的典型特征.LeryOBP3和LeryOBP7开放阅读框全长分别为357和468 bp,分别编码118和155个氨基酸.发育表达谱表明,LeryOBP3和LeryOBP7的表达量高峰出现于成虫期;组织表达谱表明,LeryOBP3在成蚜足中表达量较高,而LeryOBP7主要表达于成蚜触角组织中.[结论]在萝卜呀成虫触角中的LeryOBP7结合蛋白可能与其对EBF的响应有关.

[目的]获得荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis3个信息素结合蛋白(PBP)基因的全长序列,并分析序列和表达特征,为更好地利用性信息素防治该虫提供必要的基础.[方法]提取荔枝蒂蛀虫触角总RNA,利用转录组测序结果和RACE-PCR技术获得3个PBP基因的全长序列;对序列进行生物信息学分析,用I-TASSER在线软件建立蛋白三维模型,用TM-align软件进行同源建模,用COACH软件推测蛋白的结合位点;用荧光定量PCR方法分析这3个基因在不同龄期(幼虫和蛹)和3日龄雌雄成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足和翅]中的表达谱.[结果]从荔枝蒂蛀虫触角中克隆了3个PBP基因的全长序列,分别命名为CsinPBP1,CsinPBP2和CsinPBP3(GenBank登录号:MF093145,MF093146和MF093147).序列分析结果表明,这3个基因的编码蛋白具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,并且CsinPBP1与紫色卷蛾Yponomeuta cagnagellus PBP的氨基酸序列一致性达72％,CsinPBP2与小菜蛾Plutella xylostella PBP1的氨基酸序列一致性达55％,CsinPBP3与水稻大螟Sesamia inferens PBP3的氨基酸序列一致性达39％.软件模拟分析表明,CsinPBP1,CsinPBP2和CsinPBP3蛋白的三维结构分别与家蚕Bombyxmon普通气味结合蛋白2(GOBP2)(PDB:2wc6A)、脐橙螟Amyetois transitetella PBP1(PDB:4inxA)和家蚕PBP(PDB∶2p70A)相似度最高,分别预测得到10,7和8个结合位点.表达谱分析显示,3个基因均只在成虫触角中表达,在幼虫期和蛹期不表达,在成虫头(去除触角)、胸、腹、足和翅中也不表达,且在雄虫触角中的表达量分别是雌虫中表达量的1.94,28.19和32.94倍.[结论]获得荔枝蒂蛀虫3个PBP基因的全长序列,序列和表达分析结果提示这3个基因与雄虫感受性信息素有关.

[目的]鉴定斜纹夜蛾Spodoptera litura新的信息素结合蛋白(pheromone binding protein,PBP)基因,明确其在斜纹夜蛾不同组织中的表达水平并探讨其功能.[方法]基于已报道的烟草天蛾Manduca sexta、家蚕Bombyx mori、君主斑蝶Danaus plexippus和庆网蛱蝶Melitaea cinxia4种非夜蛾科昆虫PBP4同源基因的序列特点及与其他PBP基因在染色体上的相邻关系,通过分析实验室先前克隆到的斜纹夜蛾PBP/GOBP基因序列,克隆斜纹夜蛾PBP4同源基因;通过RT-PCR和qPCR技术测定该基因在斜纹夜蛾雌雄成虫不同组织中的表达水平;利用体外表达和荧光竞争性结合实验测定斜纹夜蛾PBP4蛋白对性信息素组分和植物气味物质的结合能力.[结果]在夜蛾科昆虫斜纹夜蛾中鉴定到首个PBP4基因,命名为SlitPBP4(GenBank登录号:MG356847),cDNA编码210个氨基酸,具有N末端信号肽、疏水性气味分子结合域及6个保守半胱氨酸等PBP的典型序列特征,其基因组DNA在保守位置也含有2个内含子;但和已报道的斜纹夜蛾3个PBP相比,PBP4的C末端明显较长.SlitPBP4在雄成虫腹部(生殖系统)极高表达,在雌雄成虫触角及其他组织中仅微弱表达或不表达.荧光竞争性结合实验结果表明,SlitPBP4蛋白与被测定的信息素组分及植物气味物质均没有明显结合能力.[结论]报道了夜蛾科昆虫的首个PBP4基因,该基因可能主要参与雄虫生殖相关的生理过程而非嗅觉功能.

[目的]通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta的Minus-C气味结合蛋白 (odorant binding protein, OBP) 基因, 并测定其在成虫不同组织中的表达量及其重组蛋白对气味配体的结合能力, 推测其嗅觉生理功能.[方法]基于梨小食心虫雌虫触角转录组测序数据, 利用RT-PCR克隆MinusC OBP基因的完整编码区;qPCR测定该基因在成虫不同组织[触角、头 (去除触角) 、胸、腹、足、翅]中的表达量;构建原核表达系统表达重组蛋白, 利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯度;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白与35种气味配体的结合能力.[结果]成功克隆了梨小食心虫的一个Minus-C OBP基因, 命名为GmolOBP14 (GenBank登录号:MF066361).GmolOBP14开放阅读框长411 bp, 编码136个氨基酸, 成熟蛋白具有4个保守的半胱氨酸残基, 属于Minus-C OBP亚家族.GmolOBP14在雌雄成虫的不同组织中均有表达, 但在雄成虫翅和雌成虫触角中的表达量显著高于同性别的其他组织.重组蛋白GmolOBP14与气味配体的结合谱较窄, 仅能与16种配体表现出不同程度的结合活性, 其中与梨酯和十二醛的结合能力较强, 解离常数Ki分别为6.92和12.74μmol/L;与癸醛、十四醛、顺-3-己烯-1-醇、苯甲醇和己酸丁酯有中等程度的结合活性, Ki分别为25.54, 20.61, 24.35, 23.44和23.33μmol/L;GmolOBP14对性信息素组分没有结合活性, 提示该蛋白不参与对性信息素的感受和识别.[结论]根据GmolOBP14基因的组织表达特点及其重组蛋白的结合特性, 推测GmolOBP14除具有选择性结合和运输寄主植物挥发物的作用外, 还参与与嗅觉无关的生理过程.

[目的]研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator气味结合蛋白MmedOBP18在触角中的表达定位,解析MmedOBP18重组蛋白的配体结合特性.[方法]原核表达中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18;采用荧光免疫组织化学技术研究MmedOBP18在中红侧沟茧蜂雌蜂触角中的表达定位;通过荧光竞争结合实验分析MmedOBP18重组蛋白与99种候选配体的结合特性.[结果]在原核表达系统中成功表达MmedOBP18重组蛋白.荧光免疫定位结果显示MmedOBP18主要表达在触角锥形感器Ⅰ内的淋巴液中.荧光竞争结合实验结果表明,MmedOBP18重组蛋白能够与16种候选配体结合,与低挥发性植物挥发物2-十三酮、十二醛、十四酸和十一酸的结合能力最强,其解离常数Ki值分别为5.21,6.42,6.49和6.58 μmol/L;而且MmedOBP18重组蛋白与非挥发性植物次生物质棕榈酸、棉酚、槲皮素及亚麻酸也有较强的结合能力,Ki值分别为3.86,5.07,5.08和6.51 μmol/L;此外,MmedOBP18重组蛋白与鳞翅目昆虫性信息素组分顺-9-十四碳烯醛及顺-11-十六碳醛表现出较强的结合能力,Ki值分别为9.09和11.67 μmol/L,提示该蛋白在寄主定位过程中可发挥重要的作用.[结论]中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18能够结合长链低挥发和非挥发性化合物,推测其在嗅觉和味觉识别中发挥双重功能,主要参与对寄主和寄主生境的化学信息的近距离识别.

[目的]明确甘薯蚁象Cylas formicarius气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP) OBP8的基因表达谱及与配体化合物的结合特性.[方法]基于甘薯蚁象成虫转录组数据,利用RT-PCR方法从甘薯蚁象成虫触角中克隆了气味结合蛋白OBP8基因,并进行生物信息学分析;采用qPCR方法测定该基因在甘薯蚁象成虫触角、口器、翅和跗节中的表达谱;构建原核表达载体,进行诱导表达及蛋白纯化.利用荧光竞争结合实验测定纯化的重组蛋白与16种配体化合物(1种性信息素和15种植物挥发物)的结合特性.[结果]获得甘薯蚁象气味结合蛋白基因CforOBP8(GenBank登录号:MH549528)的完整编码序列,其开放阅读框长414 bp,编码138个氨基酸,预测分子量为15.56 kD,等电点为4.71,N末端具有21个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸,CforOBP8属于Minus-C OBPs亚家族.荧光定量PCR结果表明,CforOBP8在甘薯蚁象成虫触角中特异性表达,在其他组织中微量表达.SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达.CforOBP8与配体化合物的结合力测试表明,CforOBP8与性信息素(E)-2-丁烯酸顺-(Z)-3十二烯基酯结合能力最强,解离常数K1为4.13 μmoL/L;其次与5种植物挥发物也有一定的结合能力,依次为乙酸顺-3-己烯酯(Ki=7.54 μmol/L)、柠檬烯(Ki=15.23 μmol/L)、橙花醇(Ki=16.31 μmol/L)、壬醛(Ki=28.71 μmol/L)和苯乙醛(Ki=29.54 μmol/L).[结论]CforOBP8可能是甘薯蚁象性信息素结合蛋白,并且在感受性信息素和寄主植物挥发物的过程中都发挥作用.