苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)是我国重大农业入侵害虫,对我国果业健康发展造成严重威胁.在利用基因编辑等技术对相关基因进行功能研究时,通常采用单对交配策略对纯合突变体进行筛选.因此,在配对前明确个体基因型,避免对虫体造成损伤尤为重要.本研究分别收集末龄幼虫蜕(10个蜕)和蛹壳(1个、5个、10个、15个蛹壳),通过基因组DNA提取、目的基因PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物测序,以评估该方法作为苹果蠹蛾基因检测的可行性.结果显示,以苹果蠹蛾末龄幼虫10个蜕及5个以上蛹壳提取的基因组DNA作为模板,扩增精巢特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Testis specific serine/threonine protein kinase,TSSK1)基因,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到单一、明亮的条带,经测序证实该产物是目的基因序列.基于高效及节约成本的原则,拟推荐利用10个末龄幼虫蜕或10个蛹壳提取基因组DNA、通过PCR扩增和测序进行苹果蠹蛾的无损伤基因型检测.本研究建立了一种利用幼虫蜕和蛹壳进行苹果蠹蛾无损伤、高效的基因检测方法,为提高苹果蠹蛾基因功能研究的效率奠定了基础.

烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)能够快速介导胆碱能突触传递,并在许多认知功能障碍性疾病的过程中发挥作用.昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体是新烟碱类等杀虫剂的重要作用靶标,而且靶标抗性是昆虫产生抗药性的一个重要机制.本文利用生物信息学结合现代分子生物学技术,以新疆石河子地区的苹果蠹蛾种群为材料,克隆获得了8个烟碱型乙酰胆碱受体nAChR亚基基因的cDNA全长序列,并对这8个亚基基因的序列进行了生物信息学分析.研究结果有助于进一步深入解析苹果蠹蛾对新烟碱类杀虫剂的靶标抗性机制,进而为开发新型靶标药剂提供科学依据和理论基础.

[目的]通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta触角中的普通气味受体(odorant receptor,OR) OR20基因,明确其在不同发育期及成虫不同组织中的表达特征,为进一步研究其功能提供理论依据.[方法]根据梨小食心虫雌虫触角转录组数据,利用RT-PCR克隆梨小食心虫OR20基因的完整开放阅读框;采用qRT-PCR检测该基因在不同发育期(卵、1-5龄幼虫、蛹和雌雄成虫)、成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足、翅)以及不同日龄(1,3,5和7日龄)成虫触角中的表达量.[结果]克隆获得梨小食心虫GmolOR20基因cDNA序列(GenBank登录号:MH898864).该基因完整开放阅读框为1 284 bp,编码427个氨基酸,预测蛋白分子量为49.83 kD,理论等电点为8.57,具有7个跨膜结构域.序列比对和系统进化树结果表明,梨小食心虫GmolOR20与苹果蠹蛾Cydia pomonella CpomOR15和豆荚小卷蛾Cydia nigricana CnigOR15亲缘关系较近,氨基酸序列一致性分别为87％和84％.发育表达模式结果显示,GmolOR20在不同发育时期均有表达,雌雄成虫中的表达量显著高于其他发育期的表达量(P＜0.05),但雌、雄虫间的表达量差异不显著.组织表达模式结果表明,GmolOR20主要在成虫触角中高丰度表达,且雌虫触角中的表达量极显著高于雄虫触角中的表达量(P＜0.01);GmolOR20在不同日龄成虫的触角中均有表达,且在1和3日龄成虫触角中的表达水平显著高于其他日龄(P＜0.05).[结论]根据GmolOR20基因的表达谱分析结果,推测GmolOR20可能参与梨小食心虫对植物挥发物和性信息素的识别.

[目的]植物在生长过程中,面对昆虫的取食危害演化出了系统而有效的防御策略.本研究探索了苹果果实应对蛀果害虫危害的防御反应机制.[方法]本文以蛀果害虫梨小食心虫Grapholithamolesta和苹果蠹蛾Cydia pomonella为研究对象,研究食心虫为害对果树防御酶活性的影响及反映寄主受其危害的应激程度.[结果]结果表明将梨小食心虫和苹果蠹蛾分别接虫子苹果果实处理后,寄主的蛋白质含量、CAT、POD和SOD活性明显高于未被危害果实且差异显著;梨小食心虫与苹果蠹蛾同时取食为害时,CAT活性4-8 d时上升,12d后开始下降;POD活性增强明显高于其它4个处理,SOD活性明显高于其它处理且差异显著(P＜0.05).[结论]苹果果实在遭受到虫害胁迫时,可诱导寄主体内防御酶出现应激反应,从而发挥重要保障作用.

[目的]本研究通过克隆苹果蠹蛾Cydia pomonella CPR (CpCPR)基因cDNA序列,并对该基因的表达模式进行分析,为深入研究P450酶系在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中的作用提供理论基础.[方法]以近缘昆虫的CPR氨基酸序列作为询问序列,在苹果蠹蛾转录组(SRX371333)中进行筛查比对,获得了苹果蠹蛾CPR(CpCPR)基因的cDNA序列.采用RT-PCR技术克隆目的基因的开放阅读框(ORF).利用生物信息学软件分析目的基因的序列特征、3D结构和与其他昆虫CPR基因的系统进化关系.采用RT-qPCR技术测定CpCPR基因在苹果蠹蛾不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)及幼虫不同组织部位(头部、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)的表达水平.[结果]克隆获得的苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF为2 052bp,编码683个氨基酸残基,预测的蛋白质分子量(Mw)为77.326ku,理论等电点(pI)为5.65.CpCPR包含FMN区域、NADPH区域和FAD等昆虫CPR的典型特征.系统发育分析表明,苹果蠹蛾CpCPR与鳞翅目昆虫CPR基因聚在一枝.RT-qPCR结果表明,CpCPR基因在苹果蠹蛾的整个发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高;CpCPR基因在4龄幼虫的各部位均有表达,在中肠中的表达量最高.[结论]克隆获得了苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF序列,该基因在苹果蠹蛾主要取食阶段和消化器官中高表达,表明其可能在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中扮演重要作用.

[目的]本研究旨在通过克隆苹果蠹蛾Cydia pomonella细胞色素P450基因CYP332A19和CYP337B19,并对其进行序列和表达分析,以更好地了解这两个P450基因在植物次生物质解毒方面的作用,为进一步的功能研究提供依据.[方法]采用本地BLAST搜索苹果蠹蛾转录组数据库获得细胞色素P450基因cDNA序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因的编码区.利用生物信息学软件分析目的基因的序列特征及与其他近缘物种的P450基因的系统进化关系.采用RT-qPCR技术测定目的基因在苹果蠹蛾不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、4龄幼虫不同组织(头部、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)以及4龄幼虫分别取食添加0.1％香豆素和0.5％槲皮素的人工饲料2d后的表达水平.[结果]克隆获得苹果蠹蛾细胞色素P450基因CYP332A19(GenBank登录号:MF574708)和CYP337B19(GenBank登录号:MF574697)的全长cDNA序列,开放阅读框(ORF)分别长1 518和1 491 bp,分别编码505和496个氨基酸,其蛋白质分子量分别为58.586和57.734kD,理论等电点分别为8.99和7.61.结构域分析显示,CYP332A19和CYP337B19中均包含包括血色素结合区在内的5个保守的细胞色素P450结构域.系统发育树显示,苹果蠹蛾CYP332A19与苹淡褐卷蛾Epighyas postvittana CYP332A9等CYP332A基因聚在一枝,而CYP337B19与稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis CYP337B12和六星灯蛾Zygaena filipendulae CYP337B11等CYP337B基因聚在另一枝.RT-qPCR分析结果表明,CYP332A19和CYP337B19在苹果蠹蛾幼虫期的表达水平高于卵期的,分别在4龄幼虫脂肪体和中肠中的表达量最高.取食分别含0.1％香豆素和0.5％槲皮素的人工饲料2d后,4龄幼虫体内的CYP332A 19和CYP337B19相对表达量显著高于对照组(取食含2％ DMSO的人工饲料).[结论]CYP332A19和CYP332B19分别在苹果蠹蛾幼虫脂肪体和中肠中高表达,且在取食含香豆素和槲皮素的人工饲料的苹果蠹蛾幼虫体内表达量升高,说明这两个基因可能参与苹果蠹蛾对外源物质的解毒代谢过程.本研究的结果有助于我们了解苹果蠹蛾对寄主次生物质解毒代谢机理,为苹果蠹蛾防治提供新思路.

[目的]通过克隆苹果蠹蛾气味结合蛋白CpomOBP20基因cDNA序列,分析其序列特征和表达谱,旨在更好地了解OBP基因在苹果蠹蛾生命活动过程中的作用,为该害虫的绿色防控提供理论支撑.[方法]采用RT-PCR法扩增苹果蠹蛾气味结合蛋白CpomOBP20基因cDNA序列,并使用生物信息学软件对其核苷酸和氨基酸序列进行分析;基于qPCR技术分析CpomOBP20基因在苹果蠹蛾4龄幼虫不同组织(头、血淋巴、表皮、脂肪体、中肠、马氏管和唾液腺)以及雌雄成虫不同末端组织(头、触角、下唇须、喙、足和翅)中的表达情况,利用分子对接研究了CpomOBP20与3种保幼激素的结合能力.[结果]苹果蠹蛾气味结合蛋白CpomOBP20基因的开放阅读框长459 bp,共编码152个氨基酸,等电点为6.30,蛋白分子质量为16.264 ku,N末端具有20个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白质序列中具有6个保守的半胱氨酸残基,属于Classical OBP.序列分析表明,CpomOBP20的氨基酸序列与小菜蛾OBP(XP_011557123.1)的一致性最高,在亲缘关系上更加接近.qPCR结果表明,CpomOBP20基因在苹果蠹蛾4龄幼虫以及雌雄成虫不同组织中均有表达,其中在4龄幼虫的血淋巴中表达量最高,在雌雄成虫表达量最高的分别是翅和足,其次是头部.分子对接结果表明,CpomOBP20与3种保幼激素均具有较好的结合能力,可能参与保幼激素的结合与转运.[结论]本研究明确了CpomOBP20的核苷酸和氨基酸序列的组成及编码蛋白的理化性质,并推测CpomOBP20的作用可能不仅局限于嗅觉识别,在非嗅觉器官中也可能起着重要的生理作用,为今后更深入地探究气味结合蛋白在苹果蠹蛾生命活动中的作用机理提供数据支撑.

苹果蠹蛾Cydia pomonella Linne是为害苹果Malus pumila Mill.、梨Pyrus spp.、桃Amygdalus persica L.等仁果类和核果类果树的重要蛀果害虫之一.为明确寄主颜色在苹果蠹蛾产卵中的作用,本文研究了不同颜色对苹果蠹蛾雌成虫产卵选择性的影响.试验采用彩色硫酸纸模拟寄主颜色,以白色为参比色,室内在不同基质颜色条件下连续饲养苹果蠹蛾成虫,测定其产卵量和计算产卵选择率.结果显示,苹果蠧蛾羽化后第2天开始产卵,基质颜色对苹果蠹蛾雌成虫产卵选择率和产卵量有显著地影响,在粉红色上的产卵选择率和产卵量显著高于其它颜色,分别为38.24％和35.0粒,草莓红(6.17％,5.1粒)和橙黄色(8.18％,3.5粒)则表现一定的趋避作用.基质颜色对不同日龄苹果蠹蛾雌成虫产卵选择性亦有显著影响,7日龄显著偏嗜浅绿色(68.31％),其它日龄明显偏嗜粉红色,且在粉红色上日产卵量均高于其它颜色.本研究结果表明寄主颜色在苹果蠹蛾产卵选择中具有重要作用,偏好在粉红色上产卵.

随着经济全球化快速发展,外来物种入侵危害日益严重."十三五"时期,我国针对当前面临的重大外来物种入侵威胁,按照基础前沿、共性关键技术与重大产品研发、典型应用示范研究3个层面,部署了一系列科技项目,取得了一批重大科研成果:阐明了入侵物种的入侵机理和进化机制,以及入侵植物与脆弱生态系统互作的调控机制;建立了潜在农业入侵生物信息分析平台,新发外来入侵物种的风险预测与评估模型,重大外来入侵物种的快速检测识别与监测预警技术,以及综合防控技术体系;围绕豚草、空心莲子草、苹果蠹蛾、番茄潜叶蛾、甜菜孢囊线虫等危害特点,开展全程防控技术应用示范."十三五"期间,基本实现了潜在入侵物种数据量持续丰富完善,新发/突发入侵物种应急防控技术产品有效储备能力增强,重大入侵物种综合防控技术体系逐步健全的良好格局.面向"十四五",建议继续支持外来物种入侵防控研究,推动"关口前移、疆域监控、灭除阻截、联控减灾"等核心技术的研发,实现有效防控生物入侵的重大目标.