目的:探索长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LINC01133对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSC）成牙骨质分化潜能的影响及其作用机制。方法:收集2021年9月至2022年1月第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科17~30岁10例就诊患者因正畸需要或因阻生拔除的牙齿共12颗，从离体牙上提取hPDLSC，分别转染靶向LINC01133小干扰RNA（small interfering RNA-LINC01133，si-LINC01133）或阴性对照小干扰RNA（small interfering RNA-negative control，si-NC），以转染si-LINC01133为实验组，转染si-NC为阴性对照组。利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测si-LINC01133的沉默效率；通过蛋白质印迹法检测hPDLSC成牙骨质分化相关蛋白包括骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙骨质附着蛋白（cementum attachment protein，CAP）、牙骨质蛋白1（cementum protein-1，CEMP-1）的表达；利用流式细胞术和线粒体超氧化物指示剂MitoSOX检测细胞线粒体活性氧产量；通过JC-1荧光染色法检测线粒体膜电位水平；利用蛋白质印迹法检测线粒体呼吸链复合体蛋白包括NADH脱氢酶［泛醌］1β亚单位8（NADH dehydrogenase［ubiquinone］1 beta subcomplex subunit 8，NDUFB8）、琥珀酸脱氢酶亚单位A（succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A，SDHA）、泛醌-细胞色素c还原酶核心蛋白1（ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1，UQCR1）、细胞色素c氧化酶亚单位4亚型1（cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1，COXⅣ）、ATP合成酶F1亚单位α（ATP synthase F1 subunit alpha，ATP5A）的表达水平。结果:hPDLSC的LINC01133表达水平被si-LINC01133有效沉默（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.385±0.128）（ t=10.72， P<0.01），沉默效率超过60%。LINC01133沉默后，hPDLSC BSP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.664±0.179）（ t=4.62， P<0.01）；CAP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.736±0.229）（ t=2.83， P<0.05）。LINC01133沉默后，hPDLSC线粒体活性氧产量显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.458±0.185） （t=4.96， P<0.05）；线粒体膜电位水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.209±0.029）（ t=53.99， P<0.01）；NDUFB8表达水平显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.683±0.397）（ t=3.45， P<0.05）；SDHA表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.428±0.228）（ t=5.02， P<0.05）。实验组UQCR1、COXⅣ和ATP5A的表达水平与阴性对照组相比差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:LINC01133可能通过调控hPDLSC线粒体功能，进而影响hPDLSC成牙骨质分化潜能。

本文将简要论述牙髓干细胞等牙源性干细胞对牙髓牙本质复合体再生的作用,以及细胞外基质蛋白、细胞外信号分子和生物支架材料等在其中可能的调控作用,以期促进干细胞或干细胞衍生物介导的牙髓牙本质复合体修复再生.

背景:甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl,Gel-MA)与经处理牙本质基质(treated dentin matrix,TDM)在一定比例下经过紫外线交联后形成的复合水凝胶支架具有良好的孔隙率、机械性能、溶胀性能及生物降解率,这为临床上年轻恒牙的牙髓再生提供了新的思路和方法.目的:探究1∶2质量比Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架对人牙髓干细胞增殖能力及成骨/成牙本质分化能力的影响.方法:将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中,采用CCK-8实验检测人牙髓干细胞在复合水凝胶支架中的增殖能力.将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中并进行成骨诱导,采用碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察矿化结节的形成情况,采用RT-PCR检测成牙相关因子(牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白)和成骨相关因子(骨钙素、Runt相关转录因子2)的基因表达.结果与结论:①CCK-8检测结果显示,前7 d的牙髓干细胞增殖能力明显升高,第10天时速度减缓;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节生成强于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05);③RT-PCR结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞中牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因表达量明显高于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05),且14 d基因表达量明显高于7 d(P<0.05).结果表明,培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力,能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力.

目的 探究多功能蛋白聚糖(Versican)V0/V1 对小鼠牙乳头细胞(mouse dental papilla cells,mDPCs)生物学行为的影响.方法 体外培养E16.5d胎鼠mDPCs,使用小干扰RNA(siRNA)沉默mDPCs的Versican V0/V1 基因,通过qRT-PCR和免疫荧光染色验证沉默效率;通过EdU实验检测细胞增殖率,划痕实验及Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力;碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色分别评估mDPCs的矿化情况,并利用qRT-PCR检测其成牙和矿化相关基因表达水平.结果 siRNA转染后,与si-NC组相比,si-Versican V0/V1 组mDPCs的增殖能力及迁移能力减弱(P＜0.01),si-Versican V0/V1 组碱性磷酸酶染色更深且矿化结节数量增加,si-Versican V0/V1 组成牙和矿化相关的基因表达量增加(P＜0.05).结论 沉默Versican V0/V1 抑制mDPCs增殖和迁移,但促进mDPCs成牙分化和矿化.

目的:探索巨噬细胞(Mφ)极化对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成牙骨质分化的影响及作用机制.方法:将THP-1 人单核细胞分别诱导为M0、M1和M2型Mφ,用RPMI 1640基础培养基或不同极化状态Mφ来源的上清液与成牙骨质诱导液等比例混合制备条件培养基(CM-Control、CM-M0、CM-M1和CM-M2)用于培养hPDLSCs,将条件培养基培养的hPDLSCs形成的细胞膜片包裹人脱矿牙本质基质(TDM)移植至裸鼠皮下进行异位牙骨质形成实验.以CM-Control组作为对照,通过HE染色实验观察类牙骨质样组织的形成;免疫荧光染色(IMF)和qRT-PCR,检测成牙骨质分化标记物骨涎蛋白(BSP)、牙骨质附着蛋白(CAP)和牙骨质蛋白-1(CEMP-1),氧化-抗氧化体系标记物超氧化物歧化酶1(SOD1)和核转录因子红系2相关因子2(NRF2)以及线粒体自噬标记物PTEN诱导假定激酶1(PINK1)和微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)的表达水平.结果:体内实验中,CM-M2组形成的类牙骨质样组织更多,CAP、CEMP-1蛋白表达量更高且伴随SOD1蛋白和PINK1、LC3蛋白表达水平升高,NRF2蛋白未见明显差异.体外实验中,CM-M2组BSP(P＜0.01)、CAP(P＜0.001)和CEMP-1(P＜0.01)的mRNA水平上升,SOD1的mRNA水平上升(P＜0.05),而NRF2的mRNA水平无统计学差异(P＞0.05),PINK1的mRNA水平上升(P＜0.05).结论:M2型Mφ可能通过上调hPDLSCs的氧化-抗氧化体系和线粒体自噬水平促进hPDLSCs的成牙骨质分化潜能.

目的:探索甲基转移酶样 7A(METTL7A)通过N6-甲基腺苷(m6A)甲基化对牙髓干细胞(DPSCs)衰老和成骨/成牙分化的影响.方法:利用慢病毒转染DPSCs获得METTL7A稳定敲低的DPSCs,利用逆转录病毒转染DPSCs获得METTL7A稳定过表达的DPSCs,实时荧光定量PCR和Western blot实验检测敲低及过表达效率.在此基础上,利用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色及定量检测METTL7A是否调控DPSCs的衰老,斑点杂交实验检测METTL7A是否调控DPSCs的m6A甲基化水平.METTL7A过表达组加入m6A甲基化抑制剂环亮氨酸(Cyc)后,利用SA-β-gal染色及定量检测和碱性磷酸酶(ALP)活性实验检测METTL7A通过m6A甲基化调控DPSCs的衰老和成骨/成牙分化.结果:利用慢病毒转染 DPSCs,与对照组(Consh)相比,METTL7A基因和蛋白在METTL7A敲低组(METTL7Ash)的表达显著降低(P＜0.01),METTL7Ash组的SA-β-gal染色及定量检测发现阳性细胞数量增加(P＜0.05);利用逆转录病毒转染 DPSCs,与对照组(Vector)相比,METTL7A 在METTL7A过表达(HA-METTL7A)组的表达显著增加(P＜0.01),HA-METTL7A组的SA-β-gal染色及定量检测显示阳性细胞数量减少(P＜0.01).此外,相比于Consh组,METTL7Ash组DPSCs的m6A甲基化修饰水平显著降低,而过表达METTL7A组DPSCs的m6A甲基化修饰水平明显升高.在此基础上,在METTL7A过表达组加入Cyc,SA-β-gal染色及其定量检测显著增加因METTL7A过表达而减少的阳性细胞数量(P＜0.01),同时也显著抑制因METTL7A过表达促进的ALP活性(P＜0.05).结论:METTL7A可能通过调控m6A甲基化水平抑制DPSCs的衰老并促进其成骨/成牙分化.

牙髓干细胞(DPSCs)是一类牙源性间充质干细胞,在一定影响因素作用下可分化为成牙本质细胞,形成修复性牙本质,这对临床治疗牙髓病及修复具有指导意义.本文系统性回顾了DPSCs成牙分化的影响因素,包括生物因素、化学因素、物理因素、基因转染、生物材料等,探究影响DPSCs向成牙本质细胞分化的条件,为龋病、牙髓及根尖周病的修复治疗以及其他领域的应用提供理论基础.

背景:现有研究已经证实外泌体可有效促进牙髓再生,而经预处理来源的外泌体其生物学功能和特性会发生显著改变,对细胞的增殖、迁移和成牙分化产生不同的影响.目的:探讨外泌体及其预处理方式在牙髓再生领域的应用现状,归纳和总结影响外泌体发挥作用的预处理方式,并阐述外泌体及其预处理方式对牙髓再生的作用.方法:检索万方、中国知网、PubMed和Web of Science数据库中2006-2022年发表的相关文献,以"外泌体,牙髓再生,预处理方式"等为中文检索词,以"Exosomes,Pulp regeneration,Preconditioning method"等为英文检索词进行检索,共纳入78篇文献进行综述分析.结果与结论:①外泌体具有良好的生物相容性、低免疫原性和无细胞毒性等优势,可以通过促进干细胞成牙、成神经和成血管化进而诱导牙髓组织的新生.②经预处理衍生的外泌体可以增强对组织的修复和再生能力,并对再生牙髓的质量有显著影响.③目前应用在牙髓再生领域中的预处理方式包括炎症刺激、低氧诱导、条件培养基和三维培养,其分泌的外泌体均能有效改善再生牙髓的质量,但是不同的预处理方式对牙髓再生的具体效果和机制在未来尚需探索.

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子 1α(PGC-1α)在人根尖牙乳头干细胞(hSCAPs)定向分化中的作用.方法:hSCAPs矿化诱导 0、3、7 d,实时荧光定量PCR检测PGC-1α的基因表达水平.转染小干扰RNA(siRNA)构建稳定低表达PGC-1α的hSCAPs,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测PGC-1α的表达水平,采用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色分别检测ALP活性和矿化水平的变化,Western blot和实时荧光定量PCR检测成牙/骨向分化相关蛋白和基因的变化.结果:PGC-1α的基因表达水平在hSCAPs定向分化过程中逐渐上调.与对照组相比,低表达PGC-1α的hSCAPs其ALP表达量下降,矿化结节减少,牙本质涎磷蛋白(DSPP)、ALP、Runt相关转录因子 2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)等成牙/骨向分化相关指标表达水平下调(P＜0.05).结论:沉默PGC-1α表达可抑制hSCAPs定向分化.

目的:探讨雌激素缺乏对大鼠根尖牙乳头干细胞(SCAPs)增殖及牙向/骨向分化能力的影响.方法:选取 20 只 8 周龄雌性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组和卵巢去势(OVX)组,每组各 10 只.全麻下OVX组摘除双侧卵巢,Sham组行相同切口保留双侧卵巢,术前、术后 1 个月分别检测两组大鼠血清雌二醇水平.1 个月后每组各处死 5 只大鼠,分离切牙根尖牙乳头组织,酶消化法分离培养两组SCAPs,采用MTT、碱性磷酸酶(ALP)活性检测、实时荧光定量PCR、Western blot检测雌激素缺乏对大鼠SCAPs增殖及成牙/成骨向分化能力的影响.将两组SCAPs细胞以明胶海绵为载体分别植入对应组别大鼠肾被膜下,8 周后取出植入组织,使用数字化X线牙片机对取出团块曝光成像及HE染色观察其矿化能力.结果:OVX组大鼠去势1 个月后血清雌二醇水平显著低于术前(P＜0.001),Sham组大鼠血清雌二醇水平术前、术后差异无统计学意义(P＞0.05).MTT结果显示,OVX组SCAPs增殖能力显著下降(P＜0.001).ALP活性检测结果显示,OVX组SCAPs的ALP活性低于Sham组(P＜0.001).实时荧光定量PCR和Western blot结果均表明OVX组SCAPs的牙本质涎磷蛋白(DSPP)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)、骨钙素(OCN)等成牙/成骨相关基因和蛋白表达低于Sham组(P＜0.01).体内移植结果显示,Sham组形成密度较高的较规则牙髓-牙本质复合体,而OVX组形成不规则结构.结论:雌激素缺乏减弱大鼠SCAPs的增殖及牙向/骨向分化能力.