目的:探索长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LINC01133对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSC）成牙骨质分化潜能的影响及其作用机制。方法:收集2021年9月至2022年1月第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科17~30岁10例就诊患者因正畸需要或因阻生拔除的牙齿共12颗，从离体牙上提取hPDLSC，分别转染靶向LINC01133小干扰RNA（small interfering RNA-LINC01133，si-LINC01133）或阴性对照小干扰RNA（small interfering RNA-negative control，si-NC），以转染si-LINC01133为实验组，转染si-NC为阴性对照组。利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测si-LINC01133的沉默效率；通过蛋白质印迹法检测hPDLSC成牙骨质分化相关蛋白包括骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙骨质附着蛋白（cementum attachment protein，CAP）、牙骨质蛋白1（cementum protein-1，CEMP-1）的表达；利用流式细胞术和线粒体超氧化物指示剂MitoSOX检测细胞线粒体活性氧产量；通过JC-1荧光染色法检测线粒体膜电位水平；利用蛋白质印迹法检测线粒体呼吸链复合体蛋白包括NADH脱氢酶［泛醌］1β亚单位8（NADH dehydrogenase［ubiquinone］1 beta subcomplex subunit 8，NDUFB8）、琥珀酸脱氢酶亚单位A（succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A，SDHA）、泛醌-细胞色素c还原酶核心蛋白1（ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1，UQCR1）、细胞色素c氧化酶亚单位4亚型1（cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1，COXⅣ）、ATP合成酶F1亚单位α（ATP synthase F1 subunit alpha，ATP5A）的表达水平。结果:hPDLSC的LINC01133表达水平被si-LINC01133有效沉默（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.385±0.128）（ t=10.72， P<0.01），沉默效率超过60%。LINC01133沉默后，hPDLSC BSP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.664±0.179）（ t=4.62， P<0.01）；CAP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.736±0.229）（ t=2.83， P<0.05）。LINC01133沉默后，hPDLSC线粒体活性氧产量显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.458±0.185） （t=4.96， P<0.05）；线粒体膜电位水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.209±0.029）（ t=53.99， P<0.01）；NDUFB8表达水平显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.683±0.397）（ t=3.45， P<0.05）；SDHA表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.428±0.228）（ t=5.02， P<0.05）。实验组UQCR1、COXⅣ和ATP5A的表达水平与阴性对照组相比差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:LINC01133可能通过调控hPDLSC线粒体功能，进而影响hPDLSC成牙骨质分化潜能。

目的:探索巨噬细胞(Mφ)极化对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成牙骨质分化的影响及作用机制.方法:将THP-1 人单核细胞分别诱导为M0、M1和M2型Mφ,用RPMI 1640基础培养基或不同极化状态Mφ来源的上清液与成牙骨质诱导液等比例混合制备条件培养基(CM-Control、CM-M0、CM-M1和CM-M2)用于培养hPDLSCs,将条件培养基培养的hPDLSCs形成的细胞膜片包裹人脱矿牙本质基质(TDM)移植至裸鼠皮下进行异位牙骨质形成实验.以CM-Control组作为对照,通过HE染色实验观察类牙骨质样组织的形成;免疫荧光染色(IMF)和qRT-PCR,检测成牙骨质分化标记物骨涎蛋白(BSP)、牙骨质附着蛋白(CAP)和牙骨质蛋白-1(CEMP-1),氧化-抗氧化体系标记物超氧化物歧化酶1(SOD1)和核转录因子红系2相关因子2(NRF2)以及线粒体自噬标记物PTEN诱导假定激酶1(PINK1)和微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)的表达水平.结果:体内实验中,CM-M2组形成的类牙骨质样组织更多,CAP、CEMP-1蛋白表达量更高且伴随SOD1蛋白和PINK1、LC3蛋白表达水平升高,NRF2蛋白未见明显差异.体外实验中,CM-M2组BSP(P＜0.01)、CAP(P＜0.001)和CEMP-1(P＜0.01)的mRNA水平上升,SOD1的mRNA水平上升(P＜0.05),而NRF2的mRNA水平无统计学差异(P＞0.05),PINK1的mRNA水平上升(P＜0.05).结论:M2型Mφ可能通过上调hPDLSCs的氧化-抗氧化体系和线粒体自噬水平促进hPDLSCs的成牙骨质分化潜能.

目的:构建Stat3-shRNA慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的信号传导及转录激活因子3(Stat3)沉默对小鼠成牙骨质细胞OCCM-30分化、凋亡、自噬的影响及相关机制.方法:构建含有Stat3 shRNA的慢病毒载体,包装慢病毒后感染OCCM-30细胞,使用嘌呤霉素筛选出稳定细胞株.采用real-time PCR和Western Blot法检测慢病毒对Stat3的抑制效果.将细胞分成空白对照组、阴性对照组和Stat3抑制组三组,采用Western Blot检测Atg-5,Beclin-1,cleaved caspase-3,survivin蛋白水平的变化,使用real-time PCR法检测BSP,OCN,osterix在mRNA水平的变化.结果:成功构建Stat3-shRNA慢病毒表达载体并用慢病毒感染OCCM-30细胞,有效降低了Stat3的mRNA和蛋白的表达量.在mRNA水平上,Stat3抑制组BSP,OCN,osterix表达量降低.由Western Blot结果可知,Stat3抑制组Atg-5,Beclin-1,survivin蛋白表达量明显降低,cleaved caspase-3蛋白表达量增加.结论:慢病毒介导的Stat3-shRNA可有效抑制OCCM-30细胞内Stat3基因表达,从而抑制细胞分化和自噬,诱导凋亡,其相关机制可能是通过抑制Stat3信号转导通路实现的.

目的:探讨Wnt家族5A蛋白(Wnt5a)在小鼠出生后牙骨质中的表达特点以及其对体外培养成牙骨质细胞分化的影响,阐明Wnt非经典通路调控牙根发育的机制.方法:选择出生后0.5、4.5、10.5、16.5、20.5、24.5、26.5和30.5 d昆明小鼠并按以上相应时间点分组,每组3只;在相应时间点采用脱臼法处死小鼠,分离下颌第一磨牙及牙周组织.免疫组织化学染色法观察小鼠牙体和牙周组织中Wnt5a的表达特点.将小鼠成牙骨质细胞OCCM30分为实验组和对照组.实验组加入200 μg·L-1重组Wnt5a蛋白,对照组无添加;提取细胞总RNA.RT-PCR法检测2组OCCM30细胞中Ocn、Opn、Al p、Bsp、Wnt5a和Runx-2基因的相对表达水平.结果:小鼠出生后0.5d,第一磨牙牙胚中无Wnt5a阳性表达;出生后4.5d,成釉细胞和成牙本质细胞中Wnt5a阳性表达较强;出生后16.5d,可见成牙骨质细胞中Wnt5a呈阳性表达;出生后20.5～30.5 d,成牙本质细胞和牙周膜细胞中Wnt5a呈阳性表达.与对照组比较,实验组成牙骨质细胞中Ocn和Alp基因相对表达水平降低(P＜0.05).结论:Wnt5a在牙根发育过程中的表达特点为从无到有,呈现规律性表达;Wnt5a下调分化基因的表达,在牙骨质发育中发挥重要作用.

牙源性干细胞对口腔领域的新型细胞疗法的发展具有重要意义,引起广泛的关注.在牙体组织发育或再生过程中,牙源性干细胞也非常适合研究细胞过程.牙囊中的多能未分化细胞是牙源性干细胞的一种,这些细胞已被用于分化为成牙骨质细胞和成骨细胞的细胞过程的研究,对于牙周组织具有重要意义.该文关于信号通路、转录因子、细胞外基质蛋白对牙囊细胞成骨分化的研究作一综述.

目的:检测釉基质蛋白(EMD)诱导乳牙生理性根吸收不同时期的牙周膜干细胞(PDLSCs)向成牙骨质细胞方向分化的能力及矿化相关蛋白表达水平的变化.方法:选取根吸收早期(E组)、中晚期(M组)的乳牙和恒前磨牙(P组)作为组织来源,并分离培养其PDLSCs;然后再将各组PDLSCs分为2个亚组:实验组用含100 mg/mL EMD的DMEM诱导培养,对照组用DMEM培养;并于诱导7 d后检测各组细胞中CAP、CEMP-1及BSP、OCN、ALP、COL-1表达水平的差异.结果:各组细胞经EMD诱导培养7 d后,实时定量PCR检测结果显示,与对照组相比,各实验组PDLSCs中BSP、ALP、COL-1的表达水平均显著上调(P<0.05),升高幅度为P组>E组>M组;P、E、M各实验组PDLSCs中CAP、CEMP-1 mRNA的表达水平为P组>E、M组(P<0.05),E组与M组间无统计学差异(P>0.05);BSP、OCN的表达水平均为P组>E组>M组(P<0.05);ALP的表达水平为P组>E、M组(P<0.05),E组和M组间无统计学差异(P>0.05);COL-1的表达水平在各实验组间相比无统计学差异(P>0.05).免疫组化染色结果显示,P、E、M各实验组PDLSCs中BSP、OCN、ALP、COL-1均呈阳性表达,对照组则显示染色不显著.结论:EMD可诱导乳牙PDLSCs向成牙骨质细胞方向分化.随着乳牙生理性根吸收的进行,乳牙PDLSCs向成牙骨质细胞方向分化的能力及矿化相关蛋白的表达水平均逐渐降低.

目的:探讨内皮素B受体(ETBR)激动剂对成牙骨质细胞系OCCM-30生物学行为的影响,为牙源性牙根修复提供实验依据.方法:选取对数生长期的小鼠成牙骨质细胞,分为实验组和对照组.实验组采用10-6 mol·L-1 ETBR激动剂处理成牙骨质细胞,以未处理的细胞为对照组.采用MTT方法检测培养不同时间点(24、48和72 h)2组成牙骨质细胞增殖抑制率,流式细胞术检测培养不同时间点(24、48和72 h)2组细胞凋亡率,碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测细胞体外分化及矿化情况,实时定量PCR检测各组细胞中Runx2、BSP、OCN、Col1和Osterix等分化相关基因表达水平.结果:MTT检测,与对照组比较,培养24、48和72 h后,实验组细胞增殖抑制率明显升高(P＜0.05),培养48h时细胞增殖抑制率最高.流式细胞术检测,与对照组比较,实验组成牙骨质细胞凋亡率无明显变化.碱性磷酸酶和茜素红染色检测,与对照组比较,实验组细胞显色较浅,产生矿化结节较少.实时定量PCR检测,与对照组比较,在培养24 h时实验组细胞中Runx2、BSP、Osterix、OCN和Col1表达水平无明显变化,在培养48 h时上述基因表达水平开始降低,在培养72 h时细胞中Runx2、BSP、Osterix和Col1表达水平明显降低(P＜0.01).结论:ETBR激动剂可抑制成牙骨质细胞增殖和分化,但对细胞凋亡无影响.

目的 ·探讨载重组人釉原蛋白(recombinant human amelogenin,rhAm)水凝胶缓释系统对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs)增殖、迁移、黏附及成骨、成牙骨质分化能力的影响.方法 ·组织块法获取原代HPDLFs,传代培养后将第3～5代细胞分为对照组、蛋白组(20 μg/mL rhAm)、载蛋白水凝胶组(含20 μg/mL rhAm的PCLA-PEG-PCLA水凝胶).以CCK-8法检测细胞增殖与生长曲线的变化,采用划痕实验及Transwell小室实验检测细胞迁移的效果,以细胞计数法及扫描电子显微镜(电镜)观察并检测细胞黏附的效果,采用实时荧光定量PCR技术测定ALP、Runx2、CEMP1和CAP mRNA的表达,观察成骨能力的改变.结果 ·载rhAm水凝胶缓释系统对HPDLFs的生长曲线没有显著影响,对其增殖有促进作用,第3日时差异有统计学意义(P＜0.05).划痕实验和Transwell小室实验中,蛋白组迁移最快,其次为载蛋白水凝胶组.载蛋白水凝胶对HPDLFs的黏附有促进作用,4h时差异有统计学意义(p＜0.05),扫描电镜下蛋白组与载蛋白水凝胶组的细胞伸展状态较好.HPDLFs经载蛋白水凝胶诱导培养后,ALP、Runx2、CEMP1、CAP mRNA表达在不同时间点有所上调.结论 ·载rhAm水凝胶缓释系统可显著促进HPDLFs的增殖和黏附,对其迁移无显著影响,对其成骨及成牙骨质能力均有显著促进作用.

目的:通过过表达或抑制microRNA-675-5p (miR-675-5p), 观察miR-675-5p对小鼠成牙骨质细胞OCCM-30分化的影响.方法:用矿化诱导培养基诱导OCCM-30细胞分化, 检测各矿化指标及miR-675-5p的含量变化.而后利用Lipofectamine 3000脂质体分别将miR-675-5p的mimic和inhibitor及对应的negative control转染进OCCM-30细胞, 采用real-time PCR技术验证转染是否成功, 继而采用real-time PCR和Western Blot的方法检测矿化相关指标ALP, OSX, RUNX2, BSP的含量变化, 利用ALP活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性变化.结果:Real-time PCR结果显示在OCCM-30细胞分化过程中miR-675-5p表达下调, 在mimic组miR-675-5p表达上调明显, 同时ALP, OSX, RUNX2表达下降, Western Blot证明OSX, RUNX2与BSP在蛋白水平上表达同样明显降低, ALP活性试剂盒检测提示ALP活性被抑制.Inhibitor组结果与mimic组恰好相反.结论:miR-675-5p抑制OCCM-30细胞的分化能力.

目的:研究釉基质衍生物(EMD)改性后的牙本质支架表面对人牙周膜干细胞(PDLSCs)的生物学影响.方法:分离培养人PDLSCs;构建不同浓度EMD加载的牙本质支架表面;DAPI染色和CCK-8检测各组复合支架上PDLSCs的黏附和增殖活性以及细胞骨架伸展能力;q-PCR检测细胞成骨及成牙骨质相关基因的表达.结果:加载EMD组牙本质支架上的PDLSCs黏附、增殖能力增强,细胞伸展能力更强,成骨及成牙骨质相关基因表达升高,且存在一定浓度依赖效应.结论:EMD改性的牙本质支架可以促进PDLSCs的黏附、增殖、细胞伸展和成骨、成牙骨质向分化.