目的:通过筛选能成功诱导人牙髓细胞（human dental pulp cell，HDPC）向成牙本质细胞样细胞分化的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的有效浓度，探讨体内诱导HDPC进行牙本质再生的ATP适宜浓度。方法:用0（对照组）、10、400、600、800 μmol/L ATP处理HDPC后，采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）和蛋白质印迹法分别检测HDPC增殖以及成牙本质分化相关基因和蛋白[牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）]的表达；用茜素红染色评估诱导21 d后矿化结节情况（各组样本量均为5），并溶解矿化结节后定量分析各组溶液吸光度值（ A值）。筛选既能有效诱导HDPC成牙本质向分化，又能降低ATP对HDPC增殖抑制作用的浓度作为ATP的适宜浓度，并选用此浓度进行动物体内实验。HDPC经此浓度ATP预处理7 d后接种于明胶海绵上，并置入6~7 mm长、管径1.0~2.5 mm的人牙根管片段内（ATP处理组，样本量为8）；非ATP处理组的明胶海绵接种未经ATP预处理的HDPC（样本量为8），空白对照组的明胶海绵未接种细胞（样本量为2）。各组根管片段移植于免疫缺陷鼠（9只）背部双侧皮下，3个月后取材进行HE染色和组织学观察。 结果:培养5 d时与对照组相比，10 μmol/L ATP组HDPC增殖显著增加（ P<0.05），而600和800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著减小（ P<0.05），且800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著小于600 μmol/L ATP组（ P<0.05）。与对照组相比，600和800 μmol/L ATP组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均显著上调（ P<0.05），且两组间差异无统计学意义（ P>0.05），而其他各组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均无显著上调（ P>0.05）。诱导21 d后600和800 μmol/L ATP组均可见明显的矿化结节，其他组均未见矿化结节；定量分析显示0、10、400、600、800 μmol/L ATP组 A值分别为1.05±0.15、1.11±0.23、1.15±0.17、3.65±0.30、3.40±0.43，600与800 μmol/L ATP组 A值均显著大于其他各组（ P<0.05），且600与800 μmol/L ATP组间差异无统计学意义（ P>0.05）。HE染色结果显示，600 μmol/L ATP可诱导HDPC在根管牙段内分化形成牙本质样结构。 结论:600 μmol/L为ATP诱导HDPC成牙本质向分化的适宜浓度，该浓度ATP可在免疫缺陷小鼠体内诱导HDPC形成牙本质样结构。

牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）是牙髓及牙本质再生研究中关键的优选细胞，具有多向分化的能力。微量元素对DPSC分化的影响是近年口腔组织工程的研究热点。微量元素具有广泛的生理生化功能，一方面可直接调控DPSC分化、迁移和增殖能力；另一方面可通过发挥抗菌及免疫调节作用以及改变支架材料的理化特性，间接影响DPSC分化。明确微量元素在DPSC分化中的作用可为实现牙髓及牙本质再生提供更多的参考依据，本文就近年国内外关于微量元素对DPSC成牙向和成血管向分化的作用及机制研究进行综述。

牙髓再生是一种基于组织工程治疗牙髓坏死的新策略,应用种子细胞结合支架和生长因子,实现牙本质、血管和神经的新生.外泌体是一类直径约为30～150 nm的细胞外囊泡,在调控细胞间信息和物质传递中发挥重要作用.2016年以来,牙源性间充质干细胞分泌的外泌体因其在牙髓组织再生领域展现出的巨大潜力而备受瞩目.本文介绍了牙源性间充质干细胞来源外泌体的种类和培养环境,并对牙源性间充质干细胞外泌体调控细胞成牙本质向分化、血管生成、神经再生和成骨向分化的作用和机制作一综述.

目的:探讨活化α7乙酰胆碱受体(alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)联合钙离子(calcium ion,Ca2+)对LPS刺激的人牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)牙/骨向分化的影响.方法:分离培养DPSC,流式细胞术对DPSC进行表面标志物表达鉴定.CCK-8检测α7-nAChR激动剂PNU-282987和Ca2+对DPSC增殖的影响.通过碱性磷酸酶(alkaline phos-phatase,ALP)活性和染色筛选PNU-282987促进DPSC表达ALP活性的最佳浓度.用大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)模拟炎性微环境刺激DPSC.采用免疫印迹分析(Western blot,WB)、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)和茜素红染色等方法检测牙/骨向分化的相关蛋白:Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL-I)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialoprotein,DSPP)、骨钙素(osteopontin,OPN)、ALP、核心转录因子-2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX),相关基因(COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX)和矿化基质表达情况.Fura-2AM用于检测细胞内Ca2+流动情况.结果:CCK-8实验显示,PNU-282987浓度低于10 μmol/L时对细胞增殖无抑制作用,且此浓度处理LPS刺激的DPSC后ALP活性增加最明显;Ca2+浓度低于2 mmol/L对细胞增殖无抑制作用;Western blot和RT-qPCR实验显示,PNU-282987及Ca2+处理后的LPS刺激的DPSC牙/骨向分化相关蛋白(COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX)和相关基因(COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX)的表达及矿化基质形成均明显上调,二者联合后上调最显著(P<0.001).Fura-2 AM钙离子探针结果显示DPSC细胞内Ca2+浓度增加.结论:10 μmol/L PNU-282987联合2 mmol/L Ca2+可以促进LPS刺激的DPSC的牙/骨向分化能力.

牙髓干细胞(DPSCs)是一类牙源性间充质干细胞,在一定影响因素作用下可分化为成牙本质细胞,形成修复性牙本质,这对临床治疗牙髓病及修复具有指导意义.本文系统性回顾了DPSCs成牙分化的影响因素,包括生物因素、化学因素、物理因素、基因转染、生物材料等,探究影响DPSCs向成牙本质细胞分化的条件,为龋病、牙髓及根尖周病的修复治疗以及其他领域的应用提供理论基础.

牙根发育开始于牙冠发育完成后,涉及细胞增殖、分化、迁移、凋亡等诸多细胞生物学过程.表观遗传调控通过组蛋白修饰、DNA甲基化、非编码RNA调控等方式靶向调节基因表达.来自遗传小鼠模型和体外研究结果显示,这些靶向调节基因包括上皮-间质相互作用信号分子、关键细胞周期蛋白、成牙本质细胞分化及成熟的关键转录因子和功能分子等.利用遗传修饰小鼠模型结合单细胞组学等新兴生物学技术,将有助于进一步发现和阐明牙根发育的表观遗传学机制.

目的:观察微小RNA(miRNA)-148a-3p对人牙髓干细胞(DPSCs)增殖活力及成骨分化的影响,并探讨可能机制.方法:取对数期DPSCs,分为空白组、NC组、inhibitor组、inhibitor+XAV939[无翅型MMTV整合位点家族蛋白(Wnt)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路抑制剂]组.空白组不处理,NC组转染阴性对照质粒miR-148a-3p NC,inhibitor组转染miR-148a-3p inhibitor,inhibitor+XAV939组转染miR-148a-3p inhibitor并加入XAV939(40 μmol/L).转染48 h后qRT-PCR法检测miR-148a-3p表达量;MTT法检测增殖活力;ELISA法检测碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法检测矿化能力;双荧光素酶实验验证miR-148a-3p靶向基因;Western blot法检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-catenin、Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)以及Wnt1蛋白相对表达量.结果:与空白组、NC组比较,inhibitor组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量降低,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1 以及 Wnt1 蛋白表达量升高(P＜0.05);与 inhibitor组比较,inhibitor+XAV939组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量升高,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1以及Wnt1蛋白表达量降低(P＜0.05).结论:抑制miR-148a-3p表达可提升DPSCs增殖活力并促进其成骨分化,推测其作用机制与负向调控下游的靶基因Wnt1有关.

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子 1α(PGC-1α)在人根尖牙乳头干细胞(hSCAPs)定向分化中的作用.方法:hSCAPs矿化诱导 0、3、7 d,实时荧光定量PCR检测PGC-1α的基因表达水平.转染小干扰RNA(siRNA)构建稳定低表达PGC-1α的hSCAPs,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测PGC-1α的表达水平,采用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色分别检测ALP活性和矿化水平的变化,Western blot和实时荧光定量PCR检测成牙/骨向分化相关蛋白和基因的变化.结果:PGC-1α的基因表达水平在hSCAPs定向分化过程中逐渐上调.与对照组相比,低表达PGC-1α的hSCAPs其ALP表达量下降,矿化结节减少,牙本质涎磷蛋白(DSPP)、ALP、Runt相关转录因子 2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)等成牙/骨向分化相关指标表达水平下调(P＜0.05).结论:沉默PGC-1α表达可抑制hSCAPs定向分化.

目的:探讨雌激素缺乏对大鼠根尖牙乳头干细胞(SCAPs)增殖及牙向/骨向分化能力的影响.方法:选取 20 只 8 周龄雌性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组和卵巢去势(OVX)组,每组各 10 只.全麻下OVX组摘除双侧卵巢,Sham组行相同切口保留双侧卵巢,术前、术后 1 个月分别检测两组大鼠血清雌二醇水平.1 个月后每组各处死 5 只大鼠,分离切牙根尖牙乳头组织,酶消化法分离培养两组SCAPs,采用MTT、碱性磷酸酶(ALP)活性检测、实时荧光定量PCR、Western blot检测雌激素缺乏对大鼠SCAPs增殖及成牙/成骨向分化能力的影响.将两组SCAPs细胞以明胶海绵为载体分别植入对应组别大鼠肾被膜下,8 周后取出植入组织,使用数字化X线牙片机对取出团块曝光成像及HE染色观察其矿化能力.结果:OVX组大鼠去势1 个月后血清雌二醇水平显著低于术前(P＜0.001),Sham组大鼠血清雌二醇水平术前、术后差异无统计学意义(P＞0.05).MTT结果显示,OVX组SCAPs增殖能力显著下降(P＜0.001).ALP活性检测结果显示,OVX组SCAPs的ALP活性低于Sham组(P＜0.001).实时荧光定量PCR和Western blot结果均表明OVX组SCAPs的牙本质涎磷蛋白(DSPP)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)、骨钙素(OCN)等成牙/成骨相关基因和蛋白表达低于Sham组(P＜0.01).体内移植结果显示,Sham组形成密度较高的较规则牙髓-牙本质复合体,而OVX组形成不规则结构.结论:雌激素缺乏减弱大鼠SCAPs的增殖及牙向/骨向分化能力.

目的 探讨脂多糖(LPS)诱导分泌的外泌体对人牙髓干细胞(HDPSC)牙源性分化的影响及机制.方法 提取、分离及培养HDPSC,采用流式细胞术及Western blot鉴定细胞,观察成牙/成骨、成脂诱导HDPSC多向分化,筛选最适浓度LPS诱导HDPSC分泌外泌体、并提取外泌体,将HDPSC分为阴性对照组(PBS)、正常外泌体HDPSC组(N-HDPSC exo)及LPS诱导HDPSCs分泌的外泌体组(L-HDPSC exo),采用细胞增殖检测(MTT)法和流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡情况,碱性磷酸酶(ALP)染色检测各组HDPSC成骨分化表达,采用实时荧光定量PCR检测各组HDPSCs中ALP、重组人牙本质基质蛋白 1(DMP-1)、牙本质涎蛋白(DSP)及核心结合蛋白因子2(RUNX2)成骨标志基因的表达,采用Western blot检测各组HDPSCs中转化生长因子-β(TGFβ1)、转化生长因子β受体(TGFβR1)、磷酸化SMAD家族成员2/3(p-SMAD2/3)、SMAD蛋白家族成员 2/3(SMAD2/3)及SMAD蛋白家族成员4(SMAD4)蛋白的表达.结果 成功分离培养并鉴定的牙髓干细胞,成脂诱导可见红色发亮脂滴,成骨诱导可见钙化结节;LPS诱导HDPSC分泌的外泌体符合其结构特征并且可被HDPSC所摄取;L-HDPSC exo组较N-HDPSC exo组和PBS组细胞增殖能力增加、凋亡水平下降、ALP染色程度增加(P＜0.05),ALP、DMP-1、DSP及RUNX2 表达增加(P＜0.05),TGFβ1、TGFβR1、p-SMAD2/3、SMAD2/3 及SMAD4 表达增加(P＜0.05).结论 LPS诱导HDPSC分泌的外泌体可促进HDPSC增殖及细胞活力,并可促进其向成牙/成骨向分化,机制可能与调控TGFβ1/SMADs信号通路、参与诱导正常牙髓干细胞牙源性分化有关.