目的:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术建立多囊肾病1（polycystic kidney disease 1， Pkd1）基因条件敲除小鼠模型，为深入研究 Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用提供动物模型。 方法:采用In-Fusion技术构建打靶载体，根据 Pkd1基因制备对应的gRNA、Cas9 mRNA及携带loxP位点的供体载体，共同注射于C57BL/6N小鼠的受精卵内。将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部。幼鼠出生后经PCR鉴定及测序分析分选出 Pkd1 flox/flox基因型F0代阳性小鼠，后者与野生型小鼠配繁，筛选出后代基因型为 Pkd1 flox/+的F1代杂合子小鼠，内部扩繁获得基因型为 Pkd1 flox/flox的F2代纯合子小鼠，该基因型小鼠再与 Cre阳性表达的 Ggt1- Cre小鼠杂交，获得 Pkd1 flox/+Ggt1 Cre基因型的F3代小鼠，F3代自交或与F2代 Pkd1 flox/flox回交得到 Pkd1 flox/floxGgt1 Cre基因型的F4代小鼠，即肾脏特异性 Pkd1基因敲除（ Ggt1-cKO）小鼠。采用PCR法鉴定小鼠基因型，按基因鉴定结果分为野生型对照（WT）组（ n=6）、 Pkd1纯合子对照（PKD）组（ n=6）和 Ggt1-cKO敲除验证（CKO）组（ n=6）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组小鼠肾脏和其他器官组织中 Pkd1 mRNA的表达；HE染色检查各组小鼠肾组织病理改变；自动生化检测仪检测小鼠血清尿素氮和血清肌酐含量，并计算肾脏系数。 结果:PCR检测结果显示，CKO组子代小鼠基因型符合 Pkd1 flox/floxGgt1 Cre。 Pkd1基因仅在肾脏特异性表达，其余组织中均未见表达。RT-qPCR结果显示，CKO组小鼠肾脏髓质 Pkd1 mRNA相对表达量显著低于WT组和PKD组（均 P<0.05）。肉眼可见CKO组小鼠肾脏体积较WT组增大了1倍左右，光镜下可观察到CKO组小鼠肾脏有多个大小形态不一的空泡，髓质组织间隙明显增加。CKO组小鼠肾脏系数、血清尿素氮和血清肌酐含量均显著高于WT组和PKD组（均 P<0.05）。 结论:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术可成功构建 Pkd1基因条件敲除小鼠，为进一步研究 Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用机制提供动物模型。

目的:探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法:①选择 GATA1基因为目的基因，利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂)，并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2 d后，选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增，以验证共表达载体和打靶载体是否被成功导入，以及Cre是否成功去除H1细胞单克隆中的筛选标志物。②挑取经PCR验证的条带大小正确的阳性H1细胞单克隆，进行细胞培养后，提取H1细胞单克隆基因组，并且分别采用引物对1/2( GATA1 5′端臂外引物/ mCherry 3′端引物)和3/5( HygroR 5′端引物/ GATA1 3′端臂外引物)对基因组进行PCR扩增，以验证该H1细胞单克隆是否具有GATA1和mCherry正确序列。③使用构建完成的H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血功能验证实验，以确认基因编辑是否改变H1细胞特性，以及造血分化能力。选择未经基因编辑H1细胞和H1∶GATA1-mCherry细胞，置于相同的造血分化培养条件培养14 d后，分别于610 nm激发波长免疫荧光显微镜下观察，并采用流式细胞术(FCM)对细胞表面标志物CD34、CD43、CD45进行检测。选取培养至GATA1大量表达时期的H1∶GATA1-mCherry细胞，进行细胞甩片和免疫荧光染色实验。对经过基因编辑的H1∶GATA1-mCherry细胞，进行GATA1特异抗体染色体，观察其能否准确追踪并指示GATA1。 结果:①经电穿孔转入打靶载体和共表达载体后，H1细胞单克隆PCR扩增产物的电泳结果显示，H1细胞经电穿孔后，可获得2 710和945 bp的PCR扩增产物电泳条带；电泳条带为2 710 bp，说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列，但是Cre没有去除筛选标志物；条带大小为945 bp，说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列，并且Cre已去除筛选标志物，为目的H1细胞。选取24个H1细胞单克隆进行PCR验证结果显示，打靶载体和共表达载体成功敲入的H1细胞克隆、打靶载体和共表达载体成功敲入且Cre去除筛选标志的H1细胞克隆(目的细胞)及染色体纯合敲入的H1细胞比例分别为80%(20/24)、50%(10/20)和90%(18/20)。②H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血诱导培养14 d时，荧光显微镜下GATA1表达时期可见大量红色荧光，FCM检测结果显示，未经基因编辑H1细胞与H1∶GATA1-mCherry细胞相比，造血干/祖细胞群比例相似，二者CD34 +CD45 +细胞比例分别为12.4%和14.1%，CD34 +CD45 +细胞比例分别为17.0%和20.2%，表明H1∶GATA1-mCherry细胞的造血分化能力没有改变。③ GATA1高表达时期H1∶GATA1-mCherry细胞的免疫荧光染色实验结果显示，荧光显微镜下可见仅GATA1抗体染色阳性细胞有mCherry标志物，表明H1∶GATA1-mCherry细胞通过mCherry荧光蛋白对 GATA1基因的标记是准确且特异的。 结论:本研究以 GATA1为目的基因，在hPSC中快速、高效进行基因敲入，成功建立快速、实时示踪目的基因表达的方法。

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法:对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后，利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测，根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后，将打靶载体电转H9细胞系，在 hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2，进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序，根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系，通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例，采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官，于分化后不同时间点行冰冻切片，免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。 结果:H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA，最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆，其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%，所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确，正常表达干细胞标志物，核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d，出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞，分化后45 d，出现RECOVERIN阳性光感受器细胞，分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层，水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层，光感受器细胞主要分布于顶层。结论:成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系，该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致，且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具，可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究，并促进致盲疾病治疗方法的开发。

在哺乳动物细胞中,利用同源引导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因编辑策略能够实现精准的点编辑和敲入,但是HDR的低效性严重制约了该策略在精准医疗和分子设计育种中的应用.鉴于HDR机制所需的供体DNA模板不能自主募集到基因组双链断裂(double-stranded break,DSB)处,本课题组提出了供体适配系统(donor adapting system,DAS)的概念并开发出CRISPR/SpCas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统.由于SpCas9蛋白分子较大,与Gal4BD适配器结合不利于表达、病毒载体包装及活体递送等过程,因此本研究进一步采用两种小型化Cas蛋白——路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源SlugCas9变体SlugCas9-HF与 氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)源 AsCasl2a,开发了新型的 CRISPR/Gal4BD-SlugCas9 和CRISPR/Gal4BD-AsCas12a供体适配基因编辑系统.通过SSA活性报告实验初步证明了 Gal4BD与SlugCas9、AsCasl2aN-端融合对其打靶活性影响较小.通过HDR效率报告实验进行功能验证并优化供体设计方案,结果表明:对于 CRISPR/Gal4BD-AsCasl2a DAS,适配器结合序列(binding sequence,BS)与供体 5'-端融合(BS-dsDNA)效果较好;对于CRISPR/Gal4BD-SlugCas9 DAS,则 BS与供体3'-端融合(dsDNA-BS)较佳.最终,利用CRISPR/Gal4BD-SlugCas9 DAS 对 HEK293T 细胞中的 EMX1、NUDT5、AAVS1 三个基因位点分别实现了 24％、37％、31％的精准编辑,相比对照组得到了显著提高.本研究为供体适配基因编辑系统的进一步优化提供了参考和借鉴,为后续动物分子设计育种应用研究提供了新的基因编辑工具.

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用.方法:构建靶向POLQ基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、稳定单细胞克隆培养、TA克隆测序及蛋白质印迹等方法验证POLQ敲除情况;利用靶向AAVS1和FBL位点的含GFP/mCherry报告基因同源打靶载体,评估敲除的293T POLQ-/-细胞系在外源基因定点整合效率的变化,并通过测序方式验证供体报告载体是否定点整合到基因组中;最后分析POLQ敲除对293T细胞增殖和存活率的影响.结果:成功在293T细胞中稳定敲除POLQ基因;通过报告基因实验验证,敲除细胞系中外源基因定点整合效率平均提高2～7倍,且敲除POLQ基因对293T细胞系增殖和存活率没有明显影响.结论:成功利用CRISPR/Cas9技术构建具有高效定点整合能力的POLQ基因稳定敲除293T细胞系,为进一步利用该细胞系高效制备稳定整合外源基因(包括抗体基因)工程化细胞系奠定基础.

目的 利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型.方法 针对裸鼹鼠HIF-1α基因的1～4号外显子区域设计4对sgRNA序列,并成功构建表达质粒.筛选得到最优sgRNA后,转染HEK-293T细胞收集上清液测定病毒滴度.前期用pLenti-Cas9(blast)病毒感染NSF细胞,后用制备的HIF-1α-sgRNA病毒感染表达Cas9蛋白的NSF细胞.经药筛后观察荧光表达,同时提取细胞gDNA和蛋白.通过T7E1酶和Western Blot检测NSF细胞中HIF-1α基因变化及蛋白表达情况.结果 Sanger测序显示,所设计的sgRNA成功插入到pX459和pKLV2-U6-sgRNA2载体上,序列验证正确,重组质粒构建成功;T7E1酶切实验成功切除3条带,sgRNA的打靶效率为54％,Western Blot结果表明,经药筛后的裸鼹鼠NSF细胞HIF-1α基因敲除成功,蛋白水平显著降低(P=0.0019);且未发现HIF-1α敲除细胞形态的明显变化,基因敲除对细胞增殖能力无明显影响.结论 成功构建靶向裸鼹鼠HIF-1α基因的CRISPR/Cas9质粒,且质粒靶向敲除HIF-1α基因功能验证成功,将有利于裸鼹鼠耐低氧机制研究,并为人类缺氧相关疾病防治提供理论依据.

目的 利用规律成簇的间隔排列的短回文重复序列及其核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建靶向识别Her2的B细胞,探究基因编辑B细胞的抗肿瘤免疫治疗作用.方法 设计针对B细胞抗原受体(BCR)的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体上,经重组T7核酸内切酶I(T7E1)酶切实验验证sgRNA的切割效率.通过分子克隆技术从曲妥珠单抗基因中调取scFv序列并和同源臂连接在一起,构建到cppt-IRES-GFP慢病毒载体中作为同源重组模板.分别将Cas9/sgRNA表达质粒和同源模板质粒与BaEVTR包膜质粒、psPAX2-D64V骨架质粒包装成整合酶缺陷的慢病毒(IDLV),用2种慢病毒同时感染人原代B细胞进行基因编辑.将基因编辑的B细胞与Her2阳性肿瘤细胞SKBR-3共培养,通过流式检测B细胞的活化和增殖.用293T-CD40L-sBAFF饲养细胞扩增基因编辑的B细胞.从临床生物样本库获取Her2阳性乳腺癌标本构建患者来源的肿瘤类器官模型,评估基因编辑B细胞浸润、清除肿瘤的能力.结果 选择IGHD作为打靶位点、切割率最高的sgRNA(约为52％)作为最终的打靶序列.2种IDLV同时感染B细胞后,scFv整合效率明显提高,达到25％,差异有统计学意义(t=6.357,P＜0.001).对基因编辑的B细胞进行基因组PCR的结果显示,scFv基因定点敲入到了靶位点.流式检测基因编辑的B细胞能靶向识别SKBR-3,从而活化并增殖.靶向识别Her2的B细胞与293T-CD40L-sBAFF饲养细胞共培养能迅速大量扩增.Biotek活细胞实时荧光成像系统观测到靶向识别Her2的B细胞浸润、清除肿瘤类器官的能力显著增强.结论 本研究成功获得了大量靶向识别Her2的B细胞,在肿瘤类器官模型中靶向识别Her2的B细胞能有效浸润并清除肿瘤.

旨在构建人AAVS1位点定点敲入的诱导表达型ERK-SPARK激酶荧光探针的人食管鳞癌细胞株(KYSE-150).根据AAVS1 位点的DNA序列设计和已公开ERK-SPAEK荧光探针碱基序列构建了两端带有 750 bp同源臂的诱导型ERK-SPARK表达盒的同源重组供体质粒.其次,利用在线设计工具设计了 3 个靶向AAVS1位点的 sgRNA,并克隆至 pX330 骨架质粒中得到 3 个能定点切割AAVS1 位点的CRISPR/Cas9 打靶载体,将同源重组供体质粒分别与表达CRISPR/Cas9 打靶载体共转染KYSE-150 细胞,经Dox诱导表达 24 h后进行嘌呤霉素抗性筛选和流式细胞分选,得到抵抗嘌呤霉素且表达GFP的细胞亚群.再应用 PCR鉴定基因型,以及 Western blot 检测蛋白表达.对获得的细胞群提取基因组DNA并进行PCR基因型鉴定,结果显示获得片段的大小与诱导型ERK-SPARK表达盒的大小一致.蛋白表达检测结果显示,该细胞群表达了ERK-SPARK探针融合蛋白.荧光探针成像实验结果显示,在未经Dox诱导表达条件下,细胞株有极少量泄漏表达;经Dox诱导表达后,GFP荧光蛋白在细胞质内均匀分布,无明显聚集成点现象;在加入EGF激活ERK激酶后,原本在细胞质内均匀分布的GFP绿色荧光聚集成高亮度的绿色液珠.成功获得了可诱导表达检测ERK激酶活性的SPARK荧光探针的稳定细胞株,解决了瞬时表达ERK-SPARK探针效率不稳定影响实验结果准确性的问题,为后续建立基于SPARK技术的高通量蛋白激酶抑制剂的筛选平台奠定了前期研究基础.

目的 构建小鼠TDO2 基因条件性敲除打靶载体,为建立 TDO2 基因条件性敲除小鼠奠定基础.方法 根据CRISPR/Cas9 技术原理,设计并构建单链向导RNA(sgRNA)和Donor 载体,以 TDO2-201(ENSMUST00000029645.13)转录本的外显子 3 作为敲除区,在打靶基因两侧各放置一个Loxp元件,建立条件性敲除TDO2 第3 号外显子的条件性基因打靶载体.将CRISPR/Cas9 复合体和Donor载体显微注射到C57BL/6 小鼠的受精卵中,获得阳性F0 小鼠,再将阳性F0 代小鼠与 C57BL/6 小鼠交配获得 F1 代小鼠,并经PCR和基因测序鉴定F1 代小鼠基因型.结果 结果证实所构建的TDO2 基因条件性敲除打靶载体符合设计要求,成功繁育并鉴定出B6/JGpt-TDO2em1Cflox/Gpt小鼠.结论 成功构建了小鼠TDO2 基因条件性敲除打靶载体,为后续进一步构建TDO2 基因条件敲除小鼠奠定了基础.

目的 利用Red同源重组的方法构建大肠杆菌外膜蛋白A(outer membrane protein-A,OmpA)基因缺失株,为后续研究奠定一定的基础.方法 以已知大肠杆菌OmpA为靶点在其两端设计同源臂引物,以质粒pKD3为模板利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出氯霉素筛选标记序列,然后采用Red重组技术利用质粒pKD46诱导表达的重组酶通过电击的方法把外源构建打靶片段导入大肠杆菌,构建大肠杆菌OmpA基因缺失突变株.以菌落PCR方法检测基因大小,以蛋白质印迹法检测蛋白表达情况,以重组菌株培养过程的吸光度(A600)值来反映重组子的生长情况.结果 成功构建了大肠杆菌OmpA基因缺失突变株,通过蛋白质印迹法检测和细菌生长曲线测定,发现OmpA基因成功完全丢失,突变株的生长曲线与野生型的差异不显著.结论 OmpA基因缺失对大肠杆菌的生长无显著影响,为进一步研究疫苗活载体提供了一定基础.