目的 对副干酪乳杆菌(L.paracasei TK1501)发酵大豆产物中的后生元进行分离提取和体内外抑菌活性进行研究,评估该后生元在治疗幽门螺旋杆菌(Hp)感染的作用.方法 L.paracasei TK1501在无氧密闭的环境内以37℃、固态发酵参数中料水比1∶1.5,接种量5×107 CFU/mL,培养发酵32 h后,通过大孔树脂XAD-16N吸附法、阳离子交换色谱法、高效液相色谱法分离纯化,对L.paracasei TK1501后生元进行稳定性及抗菌效果分析.将50只C57雄性小鼠随机分为空白组、模型组、阴性对照组、低剂量组(0.02 mL/只)和高剂量组(0.1 mL/只),10只/组,连续灌胃4周.取血清观察胃部炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平变化,取小鼠胃组织进行HE染色.结果 L.paracasei TK1501后生元易被蛋白酶降解,热稳定性好,对酸碱、有机溶剂等不利因素有较好的耐受性(P<0.05);在体外试验中,对金黄色葡萄球菌、Hp等均有较好的杀灭作用;在动物实验中,与模型组相比,L.paracasei TK1501后生元高剂量组明显改善Hp感染(P<0.05),胃部炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平变化明显下降(P<0.05).结论 L.paracasei TK1501后生元对Hp、金黄色葡萄球菌等具有较好的抑制和杀灭效果,而在相同条件下对肠道中的正常菌群则无明显影响.

蓝细菌是唯一可进行放氧光合作用的原核微生物,基于光合蓝细菌构建"自养型细胞工厂"具有广阔前景.但以蓝细菌作为底盘进行生物燃料及化学品的合成仍存在细胞耐受能力差、产量低等问题,导致实现工业化生产的经济可行性还比较低,亟需通过合成生物学等技术手段构建新的藻株.近年来,实验室适应性进化(adaptive laboratory evolution,ALE)已被用于底盘工程中,实现了优化生长速度、增加耐受性、加强底物利用和提高产品产量等目标.ALE 在提高蓝细菌鲁棒性方面取得了一定进展,已获得了耐受高光、重金属离子、高盐和高浓度有机溶剂胁迫的进化藻株.但是,蓝细菌中的 ALE 策略效率相对较低,耐受各胁迫的分子机制并未阐释完全.本文综述了ALE 相关技术策略及其在蓝细菌底盘工程中的应用,讨论了如何借鉴其他微生物中 ALE 手段,构建更大 ALE 突变文库、增加菌株的突变频率、缩短进化时间、探索多重胁迫耐受工程菌构建原则及研究策略等,高效解析进化菌株的突变体库,构建高产量、鲁棒性强的工程菌株等,以期未来促进蓝细菌底盘的改造及其工程菌的规模化应用.

[背景]开发、筛选优良益生菌菌种是当下畜牧业的研究热点,益生菌的潜在功能也被广为挖掘.[目的]分离、筛选具有良好耐受性且高产胞外蛋白酶的菌株,研究其生物学特性和酶学性质,为后续微生物蛋白酶的制备和微生态制剂的开发提供菌种资源.[方法]采集健康水貂新鲜粪便,配制酪蛋白培养基初筛和优化Folin-酚法复筛,对筛选菌进行生物学特性研究,获得产蛋白酶能力较强、耐受性较优的菌株,并进行常规鉴定和分子生物学鉴定,最后对蛋白酶酶学性质进行研究.[结果]筛选得到一株高产蛋白酶、耐受性较优的芽孢杆菌,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),编号为 3.在初始发酵培养基条件下,酶学性质研究结果表明,该蛋白酶的最适反应温度为 70℃,最适反应pH值为 9.0,最佳金属离子激活剂为K+,Cu2+和Fe2+对酶活力有明显的抑制作用,在 20%浓度的有机溶剂作用时蛋白酶未变性失活.[结论]从水貂粪便中分离获得一株具有良好的生物学特性、酶学性质和碱性蛋白酶活性的枯草芽孢杆菌,为该菌株在实际生产应用中提供了基础保障.

[目的]筛选丁醇压力下Escherichia coli中参与溶剂压力应答的细胞信号传导途径,并从应答途径出发,提高E.coli丁醇耐受性.[方法]在丁醇压力下,利用RT-PCR分析大肠杆菌内膜压力应答途径中反应调节因子(response regulator,RR)的表达水平,通过Red同源重组以及一步克隆的方法分别构建外膜脂蛋白NlpE和分子伴侣蛋白Spy的敲除菌株E.coli JM109 (ΔnlpE)和E.coli JM109 (Δspy)及重组菌株E.coli JM 109/pQE80L-nlpE和E.coli JM 109/pQE80L-spy,并测定其溶剂耐受性和细胞膜疏水性.[结果]0.8％(V/V)丁醇处理10h后,Cpx和Bae双组分压力应答途径中的cpxR和baeR基因的表达水平分别提高了8.3和3.3倍;分别在含0.6％(V/V)四氢呋喃、0.1％(V/V)甲苯和0.6％(V/V)环己烷的培养基中培养10h后,重组菌株E.coli JM1 09/pQE80L-spy和E.coli JM 109/pQE80L-nlpE的OD600相比对照组(OD600增长0.02-0.04)分别增长了0.13-0.17和0.05-0.13,重组菌的溶剂耐受性得到了显著提高.[结论]Cpx和Bae系统参与大肠杆菌丁醇压力应答,分子伴侣蛋白Spy的过表达能够有效提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性,本研究为阐明微生物有机溶剂耐受性机制提供了理论依据.

耐有机溶剂微生物在生物燃料生产、全细胞催化、酶制剂的开发和生物修复等领域具有非常重要的作用.该文简要介绍了耐有机溶剂微生物及其耐受机制,并从基因过表达、基因敲除和全局转录机制三个方面总结了增强微生物有机溶剂耐受性的方法.通过对耐有机溶剂微生物应用的局限性进行分析,认为未来研究中应注重将微生物耐受表型和具体利用相结合,达到有机溶剂耐受和实际产出的最佳平衡状态,为耐有机溶剂工程菌的改造和选育提供参考.

目的 研究秦艽内生真菌Alternaria alternata QJ15的生长特性和抗氧化活性.方法 以菌丝生长速率为指标,评价菌株生长的最适培养基、碳氮源、pH、温度及菌株对NaCl、重铬酸钾的耐受性分别用石油醚、环己烷、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇等5种有机溶剂提取A.alternata QJ15菌丝体中的活性物质,采用DPPH法测定不同极性溶剂提取物的抗氧化活性.结果 秦艽内生真菌A.alternata QJ15菌株可在多种培养基中生长,最适固体培养基为燕麦培养基,最适生长的碳源和氮源分别为麦芽糖和酵母提取物,菌株生长pH为4.0 ～11.0,最适生长pH为8.0,菌株生长温度为16 ～ 37℃,最适生长温度为28℃,菌株对NaCl、重铬酸钾具有一定的耐受性.A.alternata QJ15菌丝体在不同极性溶剂的提取物均有抗氧化活性,其中,甲醇提取物优于其他溶剂的提取物,当3 mg·mL-1时,对DPPH自由基的清除率为46.2％.结论 秦艽内生真菌A.alternata QJ15具有较好的抗氧化潜力.

从大亚湾红树林土壤样品中分离得到产蛋白酶菌株,鉴定所产胞外蛋白酶的酶学性质以及菌株的最佳发酵培养条件.采用平板透明圈法筛选菌株,福林酚显色法测定蛋白酶的酶活,通过单因素和正交试验确定其最佳发酵培养基以及发酵条件.从壤样品中分离得到一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌DH-2,该菌株分泌的蛋白酶最适反应pH和温度分别为8.0和65℃,50℃保温处理60 min后,剩余酶活仍保留80％以上.该蛋白酶对多种金属离子、有机溶剂及表面活性剂均有较好的耐受性.确定该菌株产蛋白酶的最适条件:1％(m/V,下同)可溶性淀粉,1％胰蛋白胨、1％NaCl,初始pH 5.5及7％的接种量,40℃培养36 h.在最适条件下测得其发酵液的酶活为236.30 U/mL,约为初筛时的酶活的8倍.该蛋白酶具有较为广阔的作用温度和pH范围,金属离子、有机溶剂及表面活性剂耐受性好,酶的性质比较稳定.

云芝Trametes versicolor具有很强的环境有机污染物降解能力,其烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR)为细胞色素P450酶(Cytochrome P450s,CYPs)提供电子,参与有机污染物的降解过程.序列分析显示,云芝基因组拥有1个潜在CPR序列和多个潜在CYP序列.为深入研究云芝CPR参与细胞降解有机污染物的分子机制,实验进行了云芝CPR在大肠杆菌中异源表达和酶学特性分析.结果表明,经IPTG诱导后,去除预测的N端膜锚定区域(氨基酸残基1-24)的CPR蛋白(CPR△24)可在重组菌中实现可溶性表达,且表达蛋白的分子量与理论值(78 kDa)一致.镍离子亲和层析和分子筛层析纯化后测得其比活性为5.82 U/mg.酶学性质分析显示,重组CPR△24的最适温度和pH分别为35℃和8.0,并对一些金属离子及有机溶剂具有不同程度的耐受性.酶在35℃、pH 8.0反应条件下对NADPH的动力学参数Km和Kcat分别为19.7 μmol/L、3.31/s;对底物细胞色素c的动力学参数Km和Kcat分别为25.9μmol/L、10.2/s.以上研究为探究云芝CPR在环境有机污染物降解途径中的功能机制奠定基础.

革兰氏阴性菌包含有两层组分不同的膜结构——内膜和外膜, 对大多数革兰氏阴性菌而言, 脂多糖 (lipopolysaccharides, LPS) 是其外膜上最主要的脂质成分, 锚定在外膜小叶 (the outer leaflet of the OM) 上, 是革兰氏阴性菌固有免疫的重要组成部分.脂多糖运输系统 (lipopolysaccharide transport system, Lpt) 将胞内装配完整的LPS正确装配到外膜, 使得与脂多糖相关的阻渗、有机溶剂耐受性、疏水性抗生素耐受性、膜通透性等功能得以实现.该运输系统的正确作用主要依赖7个不同的脂多糖运输蛋白 (Lpt ABCDEFG) 协同完成, 整个系统贯穿细菌内膜至外膜, 由内膜上ABC转运体复合物Lpt B2FG、胞质内转运协同蛋白Lpt A/C及被许多学者称作脂多糖运输的"命门"的外膜蛋白复合物Lpt DE共同构成.本文就革兰氏阴性菌脂多糖的具体结构功能进行简介, 进而综述脂多糖运输系统的7个蛋白的构成和作用机制, 以期为进一步研究该系统中每个蛋白的功能提供理论基础及参考.

[目的]筛选鉴定一株产酯酶用于选择性拆分 (R, S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株, 利用该菌株固定化细胞催化拆分外消旋底物.[方法]通过富集培养、罗丹明B平板初筛及复筛培养获得一株选择性拆分 (R, S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株, 通过对其形态、生理生化特征及16S r DNA序列分析, 确立该菌株系统发育地位.优化了利用硅藻土-戊二醛吸附交联法对该菌体细胞固定化的条件, 研究固定化细胞催化性质及操作稳定性.[结果]该菌为革兰氏阴性菌, 鉴定其为甲基球状菌属 (Methylopila) .固定化体系最优条件:聚乙烯亚胺0.15％ (V/V), 戊二醛0.2％ (V/V), 硅藻土6 g/L, 菌体质量浓度100 g/L.与游离细胞相比, 固定化细胞最适p H由8.0变为8.5, 最适温度由35°C变为40°C, p H稳定性和温度稳定性都有所提高.Cu2+、Mn2+、Ca2+能促进酶活, Zn2+、Fe2+抑制酶活.固定化细胞的有机溶剂耐受性较游离细胞有所提高.动力学分析细胞固定化后Km值变大, 底物亲和力降低.利用固定化细胞水解 (R, S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯, 底物浓度200 g/L, 反应20 h, 保留构型为S型, 得率47.8％, 对映体过量值ees为99.4％, 重复使用12次后仍保留初始酶活的80％以上.[结论]开发了利用Methylopila sp.cxzy-L013固定化细胞择性拆分 (R, S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的工艺, 该工艺具有良好的工业应用前景.