P450酶系在昆虫代谢农药中有重要作用,NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR)和细胞色素P450(P450)在该酶系起核心作用.昆虫具有P450超基因家族,但只有一个单一的CPR基因,CPR是昆虫所有参与农药代谢的P450酶的唯一电子供体,其影响P450活性.P450基因的高水平表达在害虫抗药性中具有重要作用,P450基因介导的昆虫抗药性是最重要的代谢抗性类型.不同P450基因的高表达的调控机制不同,引起P450基因过量表达的原因可能有P450基因的编码区突变、顺式作用元件和反式作用因子变化、基因扩增等.细胞色素P450介导的抗药性存在一定程度的进化可塑性,即同种昆虫不同种群对相同的农药产生抗药性时,导致抗性产生的P450基因不同;同一昆虫品系在某种农药的抗性选择压力下,影响抗性的P450基因的种类和表达特性会随着持续的农药选择而发生变化.最近的研究显示,CPR的变异和昆虫抗药性相关,但是昆虫CPR基因介导抗药性的机制还缺乏深入研究.全面阐释P450酶系介导昆虫抗药性的机制、建立基于P450基因表达量变化与CPR突变的抗性分子标记,对于害虫抗药性治理具有重要意义.

穿心莲内酯为传统中药穿心莲中的主要有效成分,具有多种药理活性,广泛运用于临床,但其生物合成途径尚未被解析.细胞色素P450还原酶为CYP450提供电子,在CYP450的催化过程中起重要作用.该研究通过同源比对筛选并克隆了 穿心莲CPR的编码序列,命名为ApCPR4.原核表达ApCPR4蛋白,分离纯化后进行体外酶活鉴定,发现ApCPR4能够以NADPH依赖性方式还原细胞色素c和铁氰化物.为了验证其体内功能,将ApCPR4与CYP76AH1共转化入酵母工程菌,结果表明,ApCPR4在酵母体内能够协助CYP76AH1催化生成铁锈醇.实时定量PCR结果显示,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理的叶片中,ApCPR4的表达量逐渐增加.该表达模式与穿心莲内酯受MeJA诱导积累的趋势一致,推测ApCPR4与穿心莲内酯的生物合成相关.

内质网(ER)是细胞内的一个精细的膜系统,交织分布于细胞质中,主要负责蛋白合成、修饰、加工及新生肽链的折叠、运输等.改变ER的氧化环境及其内Ca2+含量会导致内质网应激(ERS)诱导的活性氧(ROS)的产生.其中,蛋白质二硫键异构酶、内质网氧化还原酶、谷胱甘肽/谷胱甘肽脱水酶、NADPH氧化酶4、细胞色素P450酶、Ca2+及线粒体呼吸链蛋白发挥着重要的作用.本文回顾了持续的ERS和蛋白质错误折叠引发的ROS级联及其相关机制.

云芝Trametes versicolor具有很强的环境有机污染物降解能力,其烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR)为细胞色素P450酶(Cytochrome P450s,CYPs)提供电子,参与有机污染物的降解过程.序列分析显示,云芝基因组拥有1个潜在CPR序列和多个潜在CYP序列.为深入研究云芝CPR参与细胞降解有机污染物的分子机制,实验进行了云芝CPR在大肠杆菌中异源表达和酶学特性分析.结果表明,经IPTG诱导后,去除预测的N端膜锚定区域(氨基酸残基1-24)的CPR蛋白(CPR△24)可在重组菌中实现可溶性表达,且表达蛋白的分子量与理论值(78 kDa)一致.镍离子亲和层析和分子筛层析纯化后测得其比活性为5.82 U/mg.酶学性质分析显示,重组CPR△24的最适温度和pH分别为35℃和8.0,并对一些金属离子及有机溶剂具有不同程度的耐受性.酶在35℃、pH 8.0反应条件下对NADPH的动力学参数Km和Kcat分别为19.7 μmol/L、3.31/s;对底物细胞色素c的动力学参数Km和Kcat分别为25.9μmol/L、10.2/s.以上研究为探究云芝CPR在环境有机污染物降解途径中的功能机制奠定基础.

目的:研究白及有效成分Militarine在肝微粒体中的体外代谢途径及其酶促反应动力学特征.方法:建立大鼠和人肝微粒体体外孵育体系,对Militarine进行体外孵育反应;采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术,结合UNIFI数据库并参考文献对其代谢产物进行结构鉴定.同时,以葛根素为内标,采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用技术对Militarine在大鼠肝微粒体中的代谢转化量进行定量分析,通过GraphPad Prism 5.0软件拟合代谢转化曲线,并计算在有/无还原性辅酶Ⅱ(NADPH)参与的反应条件下的Militarine酶促动力学参数[最大清除速率(vmax)、米氏常数(km)、固有清除率(CLint)].结果:Milita-rine在大鼠和人肝微粒体中孵育后,生成了1个化学式为C21H29O11的化合物,推测其为Militarine的酯键水解代谢产物.酶促动力学研究显示,有/无NADPH参与的Militarine酶促反应的vmax分别为1.955、2.129 nmol/(h·mg),km分别为8.601、9.854 nmol/mL,CLint分别为0.2273、0.2161 mL/(h·mg),两者无明显差异.结论:Militarine在肝微粒体中的主要代谢途径为C1或C4位酯键的水解;其代谢不依赖于由NADPH启动反应的细胞色素P450酶代谢途径.

[目的]本研究通过克隆苹果蠹蛾Cydia pomonella CPR (CpCPR)基因cDNA序列,并对该基因的表达模式进行分析,为深入研究P450酶系在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中的作用提供理论基础.[方法]以近缘昆虫的CPR氨基酸序列作为询问序列,在苹果蠹蛾转录组(SRX371333)中进行筛查比对,获得了苹果蠹蛾CPR(CpCPR)基因的cDNA序列.采用RT-PCR技术克隆目的基因的开放阅读框(ORF).利用生物信息学软件分析目的基因的序列特征、3D结构和与其他昆虫CPR基因的系统进化关系.采用RT-qPCR技术测定CpCPR基因在苹果蠹蛾不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)及幼虫不同组织部位(头部、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)的表达水平.[结果]克隆获得的苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF为2 052bp,编码683个氨基酸残基,预测的蛋白质分子量(Mw)为77.326ku,理论等电点(pI)为5.65.CpCPR包含FMN区域、NADPH区域和FAD等昆虫CPR的典型特征.系统发育分析表明,苹果蠹蛾CpCPR与鳞翅目昆虫CPR基因聚在一枝.RT-qPCR结果表明,CpCPR基因在苹果蠹蛾的整个发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高;CpCPR基因在4龄幼虫的各部位均有表达,在中肠中的表达量最高.[结论]克隆获得了苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF序列,该基因在苹果蠹蛾主要取食阶段和消化器官中高表达,表明其可能在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中扮演重要作用.

目的:探讨当飞利肝宁胶囊对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠的治疗作用及潜在机制.方法:雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组和当飞利肝宁(0.42 g·kg-1·d-1)组,每组10只.除正常组外,其他小鼠给予高脂饲料喂养12周,以诱导模型.造模后,各组小鼠灌胃给予相应药物干预,连续4周.末次给药后,取血清,收集肝组织.生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平;油红O染色和HE染色后观察肝组织形态学变化.试剂盒检测肝组织TC、TG、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;PCR检测肝脏核因子E2相关因子2(Nrf2)、细胞色素P450家族成员2E1(CYP2E1)、血红素氧合酶1(HO-1)、NADPH醌氧化还原酶(NQO1)、谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)的mRNA表达;Western blot检测肝脏Nrf2和CYP2E1的蛋白表达.结果:①与模型组相比,当飞利肝宁组小鼠血清ALT、AST、TC和LDL水平显著降低(P＜0.05).②当飞利肝宁胶囊能明显降低模型小鼠的肝脏TG水平(P＜0.05),且明显减轻模型小鼠肝组织肝细胞脂肪变性、脂质堆积;与模型组相比,当飞利肝宁组小鼠肝脏SOD活性明显升高(P＜0.05),MDA含量显著降低(P＜0.05).③模型组小鼠肝脏Nrf2、HO-1、GSTP1、NQO1及CYP2E1的mRNA表达水平较正常组均显著下降(P＜0.05,P＜0.01),当飞利肝宁胶囊干预可明显上调模型小鼠肝脏Nrf2、GSTP1及NQO1的mRNA表达水平(P＜0.05).④模型组小鼠肝脏Nrf2和CYP2E1的蛋白表达水平较正常组明显降低(P＜0.05,P＜0.01),当飞利肝宁胶囊干预可明显升高模型小鼠肝脏Nrf2和CYP2E1的蛋白表达水平(P＜0.05).结论:当飞利肝宁胶囊对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠具有良好的治疗作用,其作用机制与降低Nrf2介导的肝脏氧化应激水平有关.

血红素加氧酶(HO)通过细胞色素P450还原酶(CPR)从NADPH传递电子,催化血红素降解为胆绿素、CO和铁的限速步骤.然后胆绿素还原酶(BVR)催化胆绿素转化为胆红素.目前已用突变结合动力学、光谱(荧光和核磁共振)、表面等离子体共振、交联、凝胶过滤和分析超速离心研究等评估血红素加氧酶-2(HO-2)与细胞色素P450还原酶(CPR)、胆绿素还原酶(BVR)的相互作用.本文介绍哺乳动物血红素降解途径中蛋白质的相互作用的研究进展.

天然异胡椒醇作为一种植物来源香料,具有很高的经济价值.目前国内外还未见利用大肠杆菌工程菌株转化生产异胡椒醇的报道.[目的]构建工程菌,采用生物合成方法获得天然香料异胡椒醇.[方法]对来自胡椒薄荷的细胞色素P450家族的柠檬烯-3-羟化酶(LIM3H)基因PM2进行改造,截短LIM3H的N端疏水区,分别添加17a短肽或2B1短肽增加其亲水性,采用CO差示光谱法检测LIM3H活性;将N端疏水区截短后的来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NADPH-细胞色素P450还原酶基因(trATR)和修饰后LIM3H基因(Modi-LIM3H)融合后表达,最终以柠檬烯为底物进行全细胞转化.[结果]3种N端修饰LIM3H基因均检测到LIM3H表达和异胡椒醇生成,其中17a短肽修饰后的蛋白表达量最高,异胡椒醇产量达到1.94 mg/L.[结论]本研究在大肠杆菌中增加外源LIM3H与ATR,成功催化柠檬烯生成异胡椒醇,为天然异胡椒醇的生产提供了新的方法.

烟草甲Lasioderma serricorne是一种重要的仓储害虫,长期化学防治导致烟草甲已对多种传统熏蒸剂产生抗性,但其对新型熏蒸剂甲酸乙酯仍处于敏感水平.因此明确其体内细胞色素 P450 还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)对甲酸乙酯的代谢解毒功能,对开展该药剂的抗性监测及延缓抗性的发生发展具有重要意义.本研究旨在克隆烟草甲LsCPR基因,分析其分子特征和表达特性,为进一步明确其在烟草甲对甲酸乙酯解毒代谢过程中的作用奠定基础.利用RT-PCR技术克隆烟草甲LsCPR基因的开放阅读框(open reading frame,ORF);利用生物信息学软件分析LsCPR编码蛋白的结构、特征和系统进化关系.采用实时定量PCR技术检测LsCPR在烟草甲不同发育阶段(低龄幼虫、高龄幼虫、蛹、低龄成虫、高龄成虫)、幼虫不同组织(表皮、肠道、脂肪体和马氏管)以及甲酸乙酯熏蒸胁迫后的表达模式.烟草甲LsCPR基因的ORF为2046 bp(GenBank登录号:MZ423209),编码681 个氨基酸,具有典型的昆虫CPR基因FMN区域、NADPH区域和FAD等保守结构域.系统发育分析表明,烟草甲LsCPR与鞘翅目昆虫聚为一支,且与赤拟谷盗Tribolium castaneum CPR亲缘关系最近.LsCPR在烟草甲不同发育阶段均有表达,在高龄幼虫期的表达水平较高;在幼虫体内的表达部位主要在肠道,其次为脂肪体和马氏管,而在表皮的表达水平最低.LC10、LC30和LC503 种浓度的甲酸乙酯处理24 h后,烟草甲LsCPR表达量随着胁迫浓度升高而上调且显著高于对照;甲酸乙酯LC50处理烟草甲不同时间(3、6、12、24 和 48 h)后,LsCPR基因上调表达,24 h时达到表达高峰.推测LsCPR是参与烟草甲代谢甲酸乙酯的候选基因.