目的 构建艰难梭菌高毒力株2型毒素B(TcdB2)的枯草芽胞杆菌工程株,获得高效表达的生物活性TcdB2蛋白.方法 以ST1/RT027型菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得TcdB2全长基因片段,构建到PHT01载体中,转化枯草芽胞杆菌WB800N菌株,进行原核表达获得TcdB2全长蛋白,进一步通过细胞毒性试验验证重组TcdB2的生物活性.结果 成功构建了高效表达TcdB2的枯草芽胞杆菌工程株,并获得具有细胞毒性的重组蛋白TcdB2.结论 具有生物活性的重组TcdB2蛋白,为进一步研究艰难梭菌高毒力株的致病机制和作为疫苗候选靶标等奠定了基础.

目的:探讨罗汉果山奈酚(kaempferol,KF)联合枯草芽胞杆菌肽聚糖(peptidoglycan,PG)对肝癌细胞HepG2生物学活性的影响.方法:以两因素(KF和PG)六水平(0、10、20、40、60、80 μmol/L)设计KF和PG正交实验,采用MTT法筛选出抑制HepG2 增殖的最佳KF和PG组合浓度.将HepG2 细胞分为对照组、PG组(40 μg/mL)、KF组(40 μmol/L)、联合组(40 μg/mL PG+40 μmol/L KF),分别干预 48 h后,采用倒置显微镜观察细胞形态与分布;划痕试验检测细胞迁移率;通过流式细胞实验检测HepG2细胞凋亡率;用Western blot法检测HepG2细胞的Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt水平;qPCR检测Bax和Bcl-2 mRNA水平.结果:HepG2 细胞增殖抑制率随PG和KF浓度的升高而明显增加(P＜0.05),二者最佳组合浓度为 40 μg/mL+40 μmol/L;在此浓度作用下,与PG组和KF组相比,联合用药对HepG2 细胞增殖呈现出明显的抑制效果,细胞形态逐渐皱缩,迁移能力明显下降(P＜0.05),凋亡率显著提高(P＜0.05);Bax蛋白表达水平显著升高(P＜0.05),Bcl-2、p-Akt蛋白表达显著下调(P＜0.05);Bax mRNA水平显著升高(P＜0.05),Bcl-2 mRNA水平显著降低(P＜0.05).结论:KF与PG联合能有效增强单独应用KF或PG对HepG2细胞增殖的抑制作用和凋亡效果,其机制可能与调节Bax、Bcl-2、p-Akt表达水平有关.

目的 研究3味中草药(金银花、蒲公英、紫花地丁)不同组合的水提取液的抗菌和抗癌活性.方法 微孔浊度法检测三种药材不同组合的水提取液对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌生长的抑制作用;MTT法检测水提取液对白血病细胞K562、前列腺癌细胞PC3、乳腺癌细胞MDA生长的抑制作用,并用流式细胞术及倒置荧光显微镜检测其对癌细胞的诱导凋亡作用.结果 不同组合的3味中药水提取液均具有一定的抗菌及抗癌活性;3味中草药同等质量组合的水提取液的抗菌活性和抗白血病细胞K562生长作用最强,且能显著诱导K562细胞凋亡.结论 3味中药等质量组合的水提液的抗菌和抗癌活性最强,抗癌作用具有选择性.

本研究利用生物信息学方法预测梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp) Trx蛋白的生物学性质.Trx蛋白无信号肽,定位在细胞质.二级结构无规卷曲占41.9％,β片层为55％,使用枯草芽胞杆菌Trx蛋白结构(PDB:2gzz.1.A)进行同源建模,获得Trx蛋白三级结构.根据Tp Trx基因序列设计引物,以Tp DNA为模板,PCR扩增得到大小为318 bp的Trx基因,然后将其连接到pET30a构建重组质粒pET30-Trx,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),得到重组菌大肠杆菌.利用IPTG诱导目的蛋白表达,该质粒编码的重组Trx蛋白分子量约为16 kDa.使用Ni2+亲和层析纯化获得重组Trx蛋白,发现Trx蛋白具有二硫键还原酶活性.利用菌落计数法观察重组大肠杆菌在H2O2胁迫下的存活率,发现能表达Trx蛋白的大肠杆菌存活率高于对照.本研究利用生物信息学方法分析了Tp Trx蛋白的性质,并发现它具有抗氧化功能,本研究为解析Tp的抗氧化机制提供实验依据.

目的 评价一元低腐蚀性过氧乙酸消毒液对连接于模拟内镜染菌载体上的枯草芽胞杆菌黑色变种芽胞的消毒和灭菌效果,并临床观察验证过氧乙酸消毒液消毒的有效性和时效性.方法 采用人工模拟内镜试验方式,选择手工清洗消毒方式研究过氧乙酸消毒液消毒(灭菌)的有效性和时效性,并采用活菌计数方法评价消毒灭菌效果;观察过氧乙酸消毒液对临床使用过内镜消毒效果.结果 对连接于模拟内镜染菌载体上芽孢,消毒作用5 min,可达到高水平消毒;浸泡15 min,可达灭菌效果.过氧乙酸消毒液以手工清洗消毒方式用于模拟内镜消毒灭菌,可连续使用14 d.结论 通过试验表明使用一元过氧乙酸消毒液原液进行内镜消毒灭菌是一款理想的消毒(灭菌)剂,效果可靠,对内镜无损伤,能满足临床需要.

在枯草芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌中,yhcZ基因和yhcY基因组成双组分系统调控细菌生长,但yhcZ基因在苏云金芽胞杆菌中发挥的生物学功能尚未明确.本研究通过基因功能注释、上下游基因排列分析和氨基酸序列比对,证实苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种 HD73中HD73_5824基因为yhcZ基因,推测其与HD73_5825基因(yhcY基因)共同组成双组份系统调控细菌生长.利用同源重组技术敲除 HD73 菌株中的yhcZ基因获得缺失突变体HD (ΔyhcZ),其在LB和SSM培养基中生长均慢于野生型HD73,而互补菌株HD(ΔyhcZ::yhcZ)菌株则能够部分恢复生长,表明yhcZ基因的缺失影响了该菌株细胞的生长.在以0.4%葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中,HD(ΔyhcZ)生长速度快于HD73,表明yhcZ基因在该菌株吸收利用葡萄糖的过程中发挥重要作用.Biolog实验显示HD(ΔyhcZ)的单孔颜色变化率低于HD73,且对D/L-丝氨酸、甲酸、D-葡糖酸、L-组胺,D-乳酸甲酯以及柠檬酸等的吸收利用能力低于HD73,表明yhcZ基因能显著影响HD73菌株对碳源的利用.同时,HD(ΔyhcZ)对8% NaCl的耐受能力弱于HD73,表明该基因可能参与细菌细胞应力响应相关基因的表达与调控.以上结果表明yhcZ基因在 HD73 菌株生长过程中对葡萄糖及其他碳源的利用具有重要的促进作用.本研究结果为解析yhcZ基因调控葡萄糖及碳源利用的分子机制奠定基础,且为进一步研究细菌生长及发酵提供参考.

目的:筛选鉴定一株产耐高温β-甘露聚糖酶的天然菌株.方法:通过形态、生理生化特征及16S rDNA比对,对从水温高于68℃的热泉中分离出的一株产β-甘露聚糖酶细菌进行鉴定.结果:该菌株的最适生长温度为50℃,可在35～80℃条件下生长,确定为一种极端嗜热枯草芽胞杆菌;该菌所产的β-甘露聚糖酶可耐受90℃高温处理.结论:产耐高温β-甘露聚糖酶极端嗜热枯草芽胞杆菌的筛选鉴定,为后续重组耐高温β-甘露聚糖酶的开发奠定了基础.

毛咀地星是一种药用蘑菇,为了进一步开发利用毛咀地星,该研究探讨了毛咀地星乙醇提取物的抗氧化、抗菌和抗肿瘤活性,并采用硅胶柱色谱、制备薄层色谱和重结晶等方法,对毛咀地星乙醇提取物进行分离纯化,研究了其化学成分.结果表明:毛咀地星乙醇提取物多酚含量为10.53μg·mg-1,DPPH和·OH自由基清除能力的IC50值分别为91.35和148.76μg·mL-1;乙醇提取物对金黄葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽抱杆菌均无抑制作用;乙醇提取物在浓度为1 mg·mL-1时,对燕麦镰刀菌的抑制率为36.11％;乙醇提取物在浓度为200μg·mL-1时,对BG-803、NCI-H502和MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制率分别为18.87％、17.71％和41.23％.并从乙醇提取物中分离纯化到6个化合物,根据理化性质和波谱数据分析,化合物结构分别鉴定为5α,8α-过氧化麦角甾-6,9(11),22-三烯-3β-醇(1)、5α,8α-过氧化麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(2)、D-阿拉伯糖醇(3)、L-谷氨酸(4)、麦芽糖(5)和蔗糖(6),以上化合物均为首次从该菌中分离得到.

利用平板分离法从中华婪步甲(Harpalus sinicus)中分离得到56株共生放线菌.其中菌株BJ37具有较好的抗菌活性,其发酵液对枯草芽胞杆菌和白色念珠菌的抑菌圈直径均大于30.0 mm.进一步研究BJ37发酵液不同极性溶剂萃取物的抗菌活性,结果表明在中等极性部位存在活性物质.通过形态学特征和分子生物学分析确定该菌株相似菌株为委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae).菌株BJ37作为微生物杀菌剂潜在产生菌值得进一步研究.

目的 建立一种一次性使用无菌阴道扩张器无菌检查方法适用性试验方法.方法 按中国药典2015版通则1101项下规定的方法,以硫乙醇酸盐流体培养基作为厌氧菌和需氧菌检查培养基,以胰酪大豆胨液体培养基作为真菌和需氧菌检查培养基.以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉为试验菌进行方法适用性研究.供试品采用薄膜过滤接种法,冲洗液为0.9％氯化钠注射液,冲洗量为100 ml/膜,以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌进行无菌检查.结果 2种材质样品无菌检查均合格,阳性对照菌生长良好.结论 该方法适用于以聚丙烯和聚苯乙烯为材质的一次性使用无菌阴道扩张器的无菌检查.该方法具有污染小、方便快捷的特点,可作为医疗器械生产企业和各级监督部门进行该类产品无菌检查方法适用性试验时的参考.