目的:研究响应脱落酸(ABA)的甘草碱性亮氨酸拉链(GubZIPs)转录因子的基因表达差异,克隆并分析甘草关键酶基因的启动子序列,为解析bZIP转录因子调控甘草活性成分生物合成提供参考.方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析甘草毛状根中GubZIPs转录因子基因在外源ABA处理下的表达模式及在 3 年生甘草中的空间表达差异;利用TBtools软件从甘草基因组中提取关键酶基因的启动子片段并克隆,利用生物信息学分析启动子上潜在的关键调控元件.结果:甘草GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33 和GubZIP56 基因在不同的ABA处理条件下表达模式不同,其中GubZIP1 和GubZIP33 的响应最为显著.分析GubZIPs基因在甘草不同组织的表达差异发现,GubZIP1 和GubZIP5 在根部高水平表达,GubZIP33 和GubZIP56 在叶中高水平表达.基于甘草基因组克隆获得甘草生物合成途径中关键酶查耳酮异构酶(CHI)、查耳酮合成酶(CHS)、β-香树脂醇合酶(β-AS)基因的启动子序列,分析结果显示,CHI基因的启动子区域有 2 个G-box和 1 个A-box顺式作用元件,CHS基因的启动子区域有 2 个ABRE和 1 个G-box顺式作用元件,β-AS基因的启动子区域有 1 个ABRE和 1 个G-box顺式作用元件.结论:甘草毛状根中GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33 和GubZIP56 基因对ABA均有显著响应,采用 50 mg·L-1 的ABA处理 3 h是研究甘草中ABA相关通路较为适宜的方案.此外甘草的关键酶基因启动子上存在可与bZIP转录因子结合和响应ABA等激素的顺式作用元件;研究结果可为深入解析响应ABA的bZIP转录因子调控甘草活性成分生物合成的分子机制提供参考.

目的:对美洲茶藨子查耳酮合成酶基因进行电子克隆及生物信息学分析.方法:以黑茶藨子查耳酮合成酶基因序列和美洲茶藨子表达序列标签为基本材料(探针),运用CAP3在线软件进行序列拼接,并对其进行了生物信息学分析.结果:美洲茶藨子查耳酮合成酶基因全长1423 bp,包含1173 bp的开放阅读框,编码390个氨基酸,该蛋白是定位于细胞质的亲水性蛋白,存在三处跨膜区,二级结构主要由α-螺旋构成.结论:研究结果有利于美洲茶藨子查耳酮合成酶基因的分子作用机制等方面的研究.

目的 分析光、暗培养的杜仲愈伤组织转录组测序结果,验证杜仲愈伤组织转录组测序结果中与类黄酮合成相关基因的表达水平.方法 利用Illumina HiSeqTM 2500测序平台对光暗培养的2种杜仲愈伤组织进行转录组高通量测序,利用Trinity软件对测序结果进行De novo组装,使用BLAST软件将Unigenes序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam等数据库比对,利用FPKM值估算基因表达丰度,利用qRT-PCR验证与类黄酮合成相关基因的表达水平.结果 杜仲愈伤组织转录组测序共获得13.00 Gbp的clean data.De novo组装后共获得62 030条Unigenes,平均长度为736.40 bp.使用BLAST软件将Unigenes序列与相关数据库比对,共获得25 417条Unigenes的注释结果.其中,25 167条Unigenes注释到Nr.4 794条Unigenes和它们相关的酶(enzyme commission numbers)注释到82条KEGG通路.共获得差异表达基因1 986条.在白光(光强为12 000 lx,16h光照,8h黑暗)培养的愈伤组织中,有1 139条基因表达上调,847条基因表达下调.在KEGG富集分析中发现,有7个Unigenes与类黄酮合成相关,其中有6个Unigenes在白光培养的杜仲愈伤组织中上调表达,它们编码的酶分别为查耳酮异构酶(EC 5.5.1.6,chalcone isomerase,CHI),查耳酮合成酶(EC 2.3.1.74,chalcome synthase,CHS),类黄酮3'-羟化酶(EC l.14.13.21,flavonoid 3'-monooxygenase,F3'H),反肉桂酸4-单加氧酶(EC l.14.13.11,trans-cinnamate 4-monooxygenase,CYP),黄酮醇合成酶(EC l.14.11.23,flavonol synthase,FLS),莽草酸邻羟基肉桂转移酶(EC 2.3.1.133,shikimate-O-hydroxycinnamoyl transferase,HQT).1个Unigene下调表达,它编码的酶为无色花青素加氧酶(EC 1.14.11.19,leucocyanidin oxygenase,LDOX).qRT-PCR分析表明,与类黄酮合成相关的7个Unigenes的表达情况与转录组测序分析结果是一致的.结论 白光条件(光强为12 000 lx,16h光照,8h黑暗)可以促进类黄酮代谢途径中相关化合物的积累.

目的 对银杏进行转录组测序,分析银杏生长发育不同时期类黄酮生物合成关键基因的表达.方法 以银杏幼年树和成年树不同时期叶片作为供试材料,利用Illumina HiSeq 2000进行转录组测序,对Unigene 进行功能注释,分析银杏类黄酮生物合成关键基因的表达特征.结果 转录组测序共获得43 073条Unigene,其中35 179条被注释,基因差异表达(DEG)筛选得到5 117个基因.通过对类黄酮合成相关KEGG 途径进行分析,筛选出50条候选基因.分析50条候选基因的表达规律,发现类黄酮合成关键基因均在银杏幼叶中高表达,但在成年树与幼年树同时期叶片之间表达差异不显著.分析与类黄酮合成关系密切的13个基因发现,其中肉桂酸4-羟化酶(C4H)、查耳酮合成酶(CHS)、花青素合成酶(ANS)、花青素还原酶(ANR)和类黄酮O-甲基转移酶(FOMT)基因的表达量较高,类黄酮3′-羟化酶(F3′H)、类黄酮3′,5′-羟化酶(F3′5′H)和黄酮醇合成酶(FLS)基因的表达量则相对较低.结论 通过转录组高通量测序,筛选分析了银杏类黄酮生物合成的关键基因及其表达特征,为提高银杏类黄酮产量提供了分子生药学理论基础.

白藜芦醇合成酶(resveratrol synthase,RS)是查耳酮合酶基因家族的一个重要酶,在植物体内催化白藜芦醇的生成.白藜芦醇是植物产生的一种非黄酮多酚类代谢产物,是植物在受到生物和非生物胁迫时产生的植物抗毒素,已证实具有多种生理活性.从转录组数据库中筛选获得注释为CHS基因的CDS序列,以中间锦鸡儿cDNA为模板,克隆得到基因全长.序列分析、系统进化分析和转该基因拟南芥研究结果表明,该基因为RS基因,因此将其命名为CiRS(GenBank登录号MF678590).qRT-PCR检测分析发现,中间锦鸡儿CiRS基因的表达受到干旱、NaCl、紫外线等胁迫诱导.异源表达CiRS基因抑制了拟南芥自身AtCHS基因的表达.同时转CiRS基因拟南芥的抑菌活性强于野生型.这些结果均证实了中间锦鸡儿CiRS基因在转基因拟南芥中发挥了相应的功能.

目的:研究干旱及盐胁迫模拟条件下黄芩种子萌发及黄酮合成关键酶活性,解析黄芩种子萌发生长的抗性能力及黄酮合成路径关键酶活性的变化.方法:测定不同浓度聚乙二醇(PEG-6000)与盐(NaCl)胁迫下黄芩种子的发芽势、发芽率、相对发芽率、发芽指数、活力指数及幼苗的苗高、根长、鲜重,并对苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)、4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)、查耳酮合成酶(CHS)、黄酮合成酶(FNS)5个黄芩黄酮合成关键酶活性进行测定.结果:5％PEG-6000溶液干旱胁迫浓度对黄芩种子萌发影响较小,当PEG-6000浓度＞5％、NaCl浓度＞50 mmol/L时,各萌发指标呈降低趋势,对黄芩种子萌发生长抑制作用明显增强.黄酮合成关键酶活性整体呈现先升高后降低的趋势,但升降幅度存在差异.结论:黄芩具有一定的抗旱耐盐能力,PEG-6000＞5％、NaCl＞50 mmol/L的胁迫浓度对黄芩种子萌发生长具有抑制作用,适度干旱及盐胁迫能提高黄酮合成关键酶活性.

目的 克隆新塔花Ziziphora bungena黄酮类化合物生物合成途径中关键酶查耳酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因,对其进行组织表达特异性分析,构建原核表达载体并进行重组蛋白诱导表达.方法 结合新塔花转录组数据设计特异性引物,通过RT-PCR克隆新塔花查耳酮合成酶zbCHS基因,对其进行生物信息学分析,通过RT-PCR进一步分析其组织表达特异性,构建原核表达载体pET28a-chs,并转化至BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达.结果 zbCHS基因长1226 bp,包含一个长度为1176 bp的开放阅读框,编码319个氨基酸,其理论相对分子质量为42 848.37.该编码蛋白定位于细胞质中,不存在跨膜区及信号肽,为非分泌蛋白,有1个糖基化位点和31个磷酸化位点.α-螺旋是该蛋白多肽链中大量的结构元件,散布于整个肽链之中.系统进化树分析表明,新塔花zbCHS基因与丹参、蕾香、紫苏等亲缘关系最为接近.RT-PCR结果显示zbCHSS基因在各组织中均有所表达,在叶中表达量较高,花相对表达量次之,根、茎中表达量相对较低.原核表达载体pET28a-chs在BL21(DE3)感受态细胞表达系统中,经IPTG诱导后,有明显的重组蛋白表达,其相对分子质量为42 800,与预测相符合.结论 通过对zbCHS基因的全长cDNA克隆、组织表达特异性分析和原核表达载体的构建,为进一步研究zbCHS基因在新塔花黄酮类化合物生物合成与基因调控提供依据,最终为该药材品质的提升奠定基础.

目的 在从全基因组层面对汉麻Cannabis sativa聚酮合酶(polyketide synthases,PKSs)基因家族进行鉴定和功能分析,为解析汉麻次生代谢产物的合成与积累奠定理论基础.方法 基于已发布的高质量汉麻基因组,利用生物信息学工具对汉麻PKS基因家族进行鉴定并对其物化性质、基因结构、蛋白构象以及表达模式进行分析,利用Alphafold算法对关键PKS蛋白结构进行预测.结果 共鉴定出9个汉麻PKSs(CsPKS1～CsPKS9),分布在5条染色体上.通过对汉麻和其他物种PKS的系统发育分析,CsPKSs主要被分为3组:group1包括CsPKS2～CsPKS4与花药特异性CHS样酶(anther specific chalcone synthase-like,ASCL)同源;group2 含有 CsPKS1 和 CsPKS5～CsPKS8 为类 CHS 超家族(chalcone synthase like,CHSL)与苯戊酮合酶(valerophenone synthase,VPS)和芪类合酶(stilbene synthase,STS)等关系较密切;group 3仅含有CsPKS9,为查耳酮合成酶(chalcone synthase,CHS)参与类黄酮的合成.其中,CsPKS1 和CsPKS7串联重复,是汉麻中酚萜类化合物合成通路中的橄榄醇合成酶(olivetol synthases,OLS).此外,CsPKS5和CsPKS8可能参与汉麻芪类化合物的生物合成.CsCHS的功能在进化中相对保守,而CHS-like的CsPKS的功能出现了分化.通过对汉麻不同组织部位和不同品种腺毛的RNA-seq数据分析,汉麻PKSs基因的表达存在组织特异性,尤其与酚萜类、类黄酮、芪类次生代谢产物密切相关的基因在雌花和苞片中特异性表达.结论 为深入研究汉麻PKS基因家族的功能提供了方向,为进一步阐明汉麻中萜酚类化合物的生物合成机制和CsPKSs在汉麻中的生理功能奠定基础,并对开发新聚酮化合物药用资源提供理论基础.

目的:利用全长转录组测序技术挖掘药用大黄蒽醌类成分合成中的关键酶Ⅲ型聚酮合成酶(PKSⅢ)家族基因.方法:利用PacBio SequelⅡ平台进行药用大黄全长转录组测序,数据通过非冗余蛋白(NR)、Swiss-Prot、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、真核生物相邻类的聚簇(KOG)、基因本体(GO)数据库进行功能注释.筛选PKSⅢ家族基因全长并进行编码蛋白生物信息特征分析,借助MEGA 6.0构建PKSⅢ家族基因系统发育进化树.结合RNA-Seq数据分析,运用TBtools计算PKSⅢ家族基因的相对表达量.结果:共获得原始数据55.50 GB,52960条高质量转录本,平均长度1712.56 bp;50007条Isoforms在NR、Swiss-Prot、KEGG和KOG数据库中得到注释.GO分类注释到生物过程、细胞组分和分子功能3个类别的65个小组.KEGG代谢通路共有17637条转录本被注释于137条通路中,其中标准次生代谢通路15条.筛选到16个含开放阅读框的Isoforms,编码8个PKSⅢ家族基因,包括RoALS1-3(芦荟松合酶)、RoCHS1-3(查耳酮合酶)、RoSTS(二苯乙烯合酶)和RoPKS(聚酮合成酶)等,编码蛋白长度为391～393 aa,无信号肽或跨膜结构域,均定位于细胞质中.编码蛋白序列保守,磷酸化及糖基化位点和数目各异.大多数PKSⅢ家族基因Isoforms在药用大黄根和根茎中表达量高.药用大黄PKSⅢ家族基因与掌叶大黄、虎杖、拟南芥基因汇于一支,亲缘关系近.结论:获得药用大黄全长转录组信息特征,鉴定了8个药用大黄PKSⅢ家族基因,明确了序列及表达特征,为药用大黄蒽醌类成分合成的分子机制研究提供参考.