目的:通过在单细胞水平分析小鼠磨牙细胞间异质性，构建牙髓细胞发育的时空图谱，进一步揭示牙齿发育的过程和调控机制。方法:分别收集出生后0、3 d的C57BL/6小鼠下颌第一磨牙各10颗，制备单细胞悬液，采用单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术进行测序。从本课题组前期研究中提取出生后7 d小鼠磨牙scRNA-seq数据，与0、3 d数据进行合并分析。使用Seurat程序对测序数据进行质控、标准化、降维和聚类分析；Monocle程序进行拟时序分析，预测发育轨迹；Scillus程序进行基因本体分析，对细胞功能进行注释。使用原位杂交技术对标记基因进行体内定位，明确不同亚群细胞的体内分布和时空变化。结果:Seurat分析显示小鼠磨牙细胞具有26个细胞亚群，可分为牙髓细胞、牙囊细胞、上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞、管周细胞、胶质细胞和红细胞等八大类细胞，其中牙髓细胞包含5个亚群：成熟牙髓细胞，标记基因为柯萨奇病毒腺病毒受体（coxsackie virus and adenovirus receptor，Cxadr）；牙乳头细胞，标记基因为SPARC相关模块化钙结合蛋白2（SPARC related modular calcium binding 2，Smoc2）；周期细胞，标记基因为Ⅱ型DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase Ⅱ alpha，Top2a）；前成牙本质细胞，标记基因为棕榈酰蛋白羧酸酯酶（notum palmitoleoyl-protein carboxylesterase，Notum）；成牙本质细胞，标记基因为牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，Dspp）。随着牙胚发育，成熟牙髓细胞的比例逐渐增加，周期细胞和成牙本质细胞比例逐渐降低。原位杂交染色和基因本体分析结果显示，Cxadr+成熟牙髓细胞定位于牙冠上部，主要功能为成骨和“细胞外结构组织”；Smoc2+牙乳头细胞位于根尖，主要功能与“细胞外结构组织”和器官发育相关；Top2a+周期细胞位于牙冠下部，进行有丝分裂；Notum+前成牙本质细胞邻近上皮根鞘，和Dspp+成牙本质细胞的主要功能同为生物矿化。Monocle分析显示牙髓细胞有2条发育轨迹，从Smoc2+牙乳头细胞起始，经过Top2a+周期细胞，再分化为Cxadr+成熟牙髓细胞或成牙本质细胞。结论:scRNA-seq技术能在转录组水平充分揭示细胞间的异质性，为研究器官发育过程和调控机制提供了有力工具。

目的 评估新型生物陶瓷类材料c-Root SP对人根尖牙乳头干细胞(hSCAPs)的细胞增殖及骨诱导能力.方法 制备不同浓度c-Root SP浸提液,采用CCK-8 法检测其对hSCAPs的细胞增殖情况,使用碱性磷酸酶(ALP)活性测定法测定ALP酶水平和茜素红染色法观察钙化结节形成情况,数据采用单因素方差分析,与iRootSP对比,评价c-Root SP促进细胞增殖及骨诱导能力.结果 c-Root SP对hSCAPs的细胞增殖具有浓度依赖性,1/10 浓度浸提液增殖水平最好,c-Root SP1/5、1/10、1/1000 浓度浸提液对hSCAPs的细胞增殖的影响显著高于同浓度iRoot SP浸提液(P<0.05).成骨方面,矿化诱导 7 天,iRoot SP ALP活性显著高于c-Root SP(P<0.05),矿化诱导 14 天 c-Root SP矿化结节显著多于iRoot SP.结论 c-Root SP具有对hSCAPs的良好细胞增殖及骨诱导能力,与iRoot SP相似.

目的:探讨人牙源性干细胞（DSC）的数据独立采集（DIA）蛋白质组学的建立方法。方法:2021年8月至2022年9月于苏州口腔医院收集牙齿，培养来自不同个体的牙髓干细胞（DPSC）、牙龈间充质干细胞（GMSC）、牙周膜干细胞（PDLSC）、根尖乳头干细胞（SCAP）和人脱落乳牙来源的干细胞（SHED），每种细胞各3个样本，共计15个样本进行DIA蛋白组学测序。通过唯一肽段分布和蛋白质覆盖分布、蛋白质质量分布评估蛋白质鉴定结果，通过组内变异系数（CV）、主成分分析及样本定量相关性等方面来评估DIA数据的质量。结果:从细胞中提取的蛋白质样本合格，总样本中共鉴定出8 662个蛋白质。蛋白质鉴定的基本统计表明所鉴定的蛋白质是可靠的。差异蛋白分析显示，DSPC组与其他各组（GMSC、PDLSC、SCAP和SHED）比较，上调和下调的蛋白分别为125、168、100、102和106、107、94、107个。差异蛋白的热图显示，同DPSC比较，GMSC、PDLSC、SCAP和SHED均有不同高表达的蛋白图谱。京都基因和基因组百科全书数据库（KEGG）分析表明不同DSC的蛋白质富集在不同的信号通路。结论:本研究成功建立了不同DSC的DIA蛋白质组学分析方法，为后续研究奠定了基础。

目的:探讨雌激素缺乏对大鼠根尖牙乳头干细胞(SCAPs)增殖及牙向/骨向分化能力的影响.方法:选取 20 只 8 周龄雌性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组和卵巢去势(OVX)组,每组各 10 只.全麻下OVX组摘除双侧卵巢,Sham组行相同切口保留双侧卵巢,术前、术后 1 个月分别检测两组大鼠血清雌二醇水平.1 个月后每组各处死 5 只大鼠,分离切牙根尖牙乳头组织,酶消化法分离培养两组SCAPs,采用MTT、碱性磷酸酶(ALP)活性检测、实时荧光定量PCR、Western blot检测雌激素缺乏对大鼠SCAPs增殖及成牙/成骨向分化能力的影响.将两组SCAPs细胞以明胶海绵为载体分别植入对应组别大鼠肾被膜下,8 周后取出植入组织,使用数字化X线牙片机对取出团块曝光成像及HE染色观察其矿化能力.结果:OVX组大鼠去势1 个月后血清雌二醇水平显著低于术前(P＜0.001),Sham组大鼠血清雌二醇水平术前、术后差异无统计学意义(P＞0.05).MTT结果显示,OVX组SCAPs增殖能力显著下降(P＜0.001).ALP活性检测结果显示,OVX组SCAPs的ALP活性低于Sham组(P＜0.001).实时荧光定量PCR和Western blot结果均表明OVX组SCAPs的牙本质涎磷蛋白(DSPP)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)、骨钙素(OCN)等成牙/成骨相关基因和蛋白表达低于Sham组(P＜0.01).体内移植结果显示,Sham组形成密度较高的较规则牙髓-牙本质复合体,而OVX组形成不规则结构.结论:雌激素缺乏减弱大鼠SCAPs的增殖及牙向/骨向分化能力.

目的 比较人根尖乳头干细胞(SCAPs)、牙髓间充质干细胞(DPSCs)和牙槽骨间充质干细胞(ABMMSCs)的体外成骨分化能力.方法 取智齿和牙槽骨组织,分别提取根尖乳头干细胞、牙髓和牙槽骨间充质干细胞,待细胞贴壁后传代.在显微镜下观察原代和P3 代的细胞形态;流式细胞仪检测细胞免疫表型;实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)和 Cell Counting Kit-8 试剂盒分析细胞的衰老状态和增殖能力;成骨诱导后进行碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色以及qRT-PCR检测成骨相关基因比较成骨能力.结果 3 种细胞形态无明显差异,呈现成纤维细胞形态,长梭形,传代后细胞形态光滑一致;3 种细胞无衰老差异,均保持稳定增殖能力,SCAPs的增殖能力明显高于其他 2 种细胞,ABMMSCs的增殖能力较弱;7 d和 14d成骨诱导后ALP染色和茜素红染色表明ABMMSCs的成骨能力明显强于SCAPs和DPSCs;qRT-PCR检测显示ABMMSCs的成骨相关基因升高最为显著.结论SCAPs、DPSCs和ABMMSCs具有稳定的生物学性能,均可进行成骨分化,ABMMSCs 体外成骨能力强于 DPSCs 和SCAPs.

目的 体外培养人根尖乳头干细胞(Stem cells from apical papilla,SCAP)与牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),比较两者成骨及成牙本质能力,为干细胞应用于牙根再生研究提供理论依据.方法 采用酶消化结合组织块化法获得SCAP及PDLSCs,通过流式细胞仪检测间充质干细胞表面标记物CD90、CD146的表达,采用CCK-8法测定SCAP及PDLSCs生长曲线;通过茜素红染色、实时定量PCR,检测SCAP及PDLSCs成骨能力;实时定量PCR检测SCAP及PDLSCs牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达.结果 流式细胞仪检测结果显示两种细胞CD105、CD90及CD146表达阳性;CCK-8法结果显示SCAP增殖活力高于PDLSCs(P<0.05);茜素红染色结果显示,与PDLSCs相比,SCAP矿化结节增多;qRT-PCR结果显示,SCAP骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)较PDLSCs表达量升高(P<0.05);牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)同样较PDLSCs表达水平高(P<0.05).结论 根尖乳头干细胞与牙周膜干细胞相比有较强的增殖、成骨及成牙本质能力.

目的:探讨根尖牙乳头间充质干细胞(SCAP)移植对胶原诱导性关节炎(CIA)的影响.方法:用Ⅱ型胶原蛋白免疫20只DBA/1J品系小鼠诱导CIA,然后小鼠被随机平分为2组(SCAP治疗组及阳性对照组),于初次免疫后的第21天分别静脉注射人SCAP及PBS,另有6只正常DBA/1J小鼠作为阴性对照组.ELISA检测TNF-α及抗CⅡ抗体水平,通过关节炎指数评分组织病理学分析及显微CT分析来评估关节炎的严重程度.流式细胞分析比较各组脾脏CD4+Th细胞亚群的水平.结果:一次性静脉输入SCAP能明显降低实验性关节炎的严重程度,恢复Th亚群的平衡.结论:SCAP移植治疗能诱导调节性T细胞水平,从而获得免疫耐受,缓解CIA炎症.

目的:构建根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)细胞膜片,并对其组织学形态和成骨/成牙本质分化性能进行研究,为SCAP细胞膜片应用于年轻恒牙牙髓再生提供实验基础.方法:分离年轻恒牙第三磨牙牙乳头.进行SCAP原代培养.采用流式细胞术检测SCAP表面标志物,茜素红S染色检测其成骨/成牙本质分化.取第3代SCAP,膜片诱导液连续培养14d,形成细胞膜片.对SCAP细胞膜片进行H-E染色,组织学观察;流式细胞术检测SCAP细胞膜片的细胞周期变化;实时定量PCR (qRT-PCR)检测细胞膜片中Runx2、ALP、Col-I基因表达;Western印迹法检测细胞膜片Runx2、ALP蛋白表达水平.采用SPSS17.0软件包对实验结果进行统计学分析,两样本细胞周期检测和qRT-PCR基因检测均数的比较采用t检验.结果:组织学H-E染色显示,SCAP细胞膜片由5～6层细胞组成,细胞量大,细胞之间排列紧密,且富含细胞外基质.SCAP细胞膜片细胞周期G2+S期所占比例较低,而G1期比例较高,提示SCAP细胞膜片增殖性能受到显著抑制(P＜0.05).同时,qRT-PCR和Western印迹法结果显示,与SCAP相比,SCAP细胞膜片成骨/成牙本质分化能力显著升高(P＜0.05).结论:SCAP细胞膜片富含细胞外基质,且成骨/成牙本质分化能力高于单纯SCAP,SCAP细胞膜片应用于牙髓再生更具有优势.

目的 应用牙髓再血管化的方法,研究体外培养扩增的自体根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papillae,SCAP)在年轻恒牙根尖周炎组织再生中的作用.方法 分离培养3只比格犬SCAP,研究其生物学特性,包括:克隆形成实验、成骨、成脂、成软骨等多向分化性能以及干细胞相关表面标志物.建立年轻恒牙根尖周炎模型,通过根管冲洗和封药严格控制感染.将24颗实验牙分为4组,正常对照组:不进行任何干预的正常发育牙齿;根尖引血组:刺破根尖引血入根管;外周血组:根管内导入外周血;外周血重悬SCAP组:外周血重悬SCAP后导入根管.除正常对照组外,其余3组在完成牙髓再血管化后均行严密的冠向封闭,定期拍摄根尖X线片,观察牙根发育情况,12周后获取犬颌骨标本进行组织学观察.结果 分离培养的犬SCAP具有克隆形成能力、成骨、成脂和成软骨等多向分化潜能,STRO-1、CD146呈阳性表达,细胞角蛋白呈阴性表达.在进行牙髓再血管化12周后,在感染控制的牙根影像学上可以观察到根管壁增厚.组织学观察发现,在根尖引血组和外周血组织中根管内壁形成的新生组织均含有骨陷窝样结构,并且在外周血组中新组织与原根管壁易于分离;而在外周血重悬SCAP组根管内壁新形成的组织中可见牙本质小管样结构,无骨陷窝样结构,且厚度大于前两组,但牙本质小管的方向不一致.结论 在控制感染的前提下,SCAP在年轻恒牙根尖周炎组织再生中具有重要作用.但是由于数量的缺乏,通过根尖来源的内源性SCAP可能不足以获得真正的组织再生,而导入足够量的体外分离培养的外源性SCAP可能会实现这一目标.

目的 探讨不同浓度无机三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)对根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)增殖及分化能力的影响及促进其向成牙本质细胞分化的潜力.方法 向SCAP分别加入不同浓度MTA培养液,配制成浓度为0.01、0.02、0.1、0.2、1、2、10、20 mg/mL的MTA实验组;设不含MTA而含有15％胎牛血清的α-MEM培养液为对照组,CCK-8法测定1、3、5、7 d的细胞数,观察不同浓度MTA对SCAP增殖的影响,使用Real-time PCR检测分化相关基因牙本质涎蛋白(dentinsialoprotein,DSPP)、Runt相关转录因子(runt-related transcription factor 2,Runx2)表达的变化.结果 培养1 d时,各实验组的MTA实验组对SCAP的体外增殖的促进作用与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05);而在培养3、5及7 d时,0.01 mg/mL组的体外增殖作用比对照组高,差异有统计学意义(P<0.05),0.02、0.1、0.2、1 mg/mL组与对照组差异均无统计学意义(P>0.05),2、10、20 mg/mL组的体外增殖作用均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).Real-time PCR检测显示,经0.01 mg/mL MTA处理7 d的实验组细胞DSPP(t=-11.12,P<0.05)及Runx2(t=-10.62,P<0.05)表达水平高于对照组.结论 0.01 mg/mL浓度组对SCAP的增殖、成牙本质分化及成骨分化有显著促进作用,而高浓度MTA则抑制SCAP的增殖.