甘草是最常用的药用植物,广泛应用于食品及制药行业.甘草的化学成分主要有三萜皂苷类、黄酮类和多糖类等,具有抗氧化、免疫调节、抗病毒及抗炎保肝等多种药理作用.现代研究发现甘草提取物及有效成分(甘草酸、甘草次酸、甘草查尔酮A、甘草总黄酮等)能通过调节糖脂代谢、减轻氧化应激、改变肠道菌群、保护肠道屏障等机制达到改善及治疗代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)的目的.综述近年来甘草提取物及有效成分抗MAFLD的药理作用及机制研究进展,旨在为该类药物的临床合理应用及新药研发提供理论依据.

目的:研究黑桑枝中的化学成分.方法:采用HP20 大孔树脂柱层析、正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析以及半制备型液相色谱等对黑桑枝乙酸乙酯部位进行分离纯化,运用现代波谱学方法(UV、IR、MS、NMR)鉴定化合物的结构.结果:从黑桑枝中共分离得到 9 个化合物,分别鉴定为:2',4',2"-三羟基查尔酮-4"-O-β-D-葡萄糖苷(1)、槲皮素(2)、2,4-二羟基苯甲醛(3)、二氢槲皮素(4)、3-O-甲基槲皮素(5)、3-O-甲基槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(6)、桑黄素(7)、槲皮素-3'-O-β-D-葡萄糖苷(8)、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷(9).结论:其中,化合物 1 为一新的查尔酮葡萄糖苷类化合物,化合物 1、5、6、9 为首次从该植物中分离得到.

目的:过岗龙为植物榼藤Entada phaseoloides的干燥藤茎,民间常用于风湿骨痛的治疗,为探寻过岗龙的化学物质和活性组分,课题组对其化学成分进行系统研究.方法:取过岗龙9.0 kg,粉碎后用70％乙醇室温浸提3次,每次24 h,提取液减压浓缩,加水混悬后,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,利用正反相硅胶,LH-20羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20),小孔树脂凝胶(MCI)等柱色谱和半制备高效液相色谱对正丁醇部位进行分离纯化,应用1H-NMR,13C-NMR和MS等现代波谱分析技术结合理化性质鉴定所得化合物的结构.结果:从过岗龙70％乙醇提取物中分离得到10个化合物,分别鉴定为没食子儿茶素(1),尿嘧啶核苷(2),表没食子儿茶素(3),儿茶素(4),表儿茶素(5),原花青素B3(6),原花青素B1(7),圣草次苷(8),(-)-香橙素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)和柚皮苷二氢查尔酮(10).结论:化合物2,6～10为首次从该植物中分离得到.

2015版《中华人民共和国药典》明确规定,甘草药材中甘草苷含量不得低于0.5％,然而目前市售栽培甘草大量存在甘草苷含量不达标的现象.由于功能基因多态性对于次生代谢产物的积累至关重要,因此本文试图对甘草苷生物合成途径中的关键酶——查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)进行基因多态性分析,筛选出甘草苷高/低含量样品对应的特异基因型,为进一步解析甘草苷生物合成的分子机制提供参考.本文利用HPLC法测得60株甘草样品中4种主要黄酮类化合物(甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素)的含量,应用Spearman相关性分析及x2检验进行统计学分析,发现4种黄酮类化合物含量间具有相关关系且不同基原间含量差异显著,乌拉尔甘草＞光果甘草＞胀果甘草.因此筛选出含量最高的5株乌拉尔甘草及含量最低的5株胀果甘草分为黄酮高、低含量组,对其CHS基因进行克隆及序列分析.10株样品共获得了336条长度为1 175 bp的CHS cDNA序列,存在249个变异位点,其中错义突变位点141个,可分为137种单倍型;编码389个氨基酸残基,存在130个变异位点,可分为102种氨基酸序列类型;主流CHS氨基酸序列类型为AA-3,黄酮高含量组甘草样品特有的主流氨基酸序列类型为AA-35,黄酮低含量组甘草样品特有主流氨基酸序列类型为AA-36,AA-35与AA-36在193位与229位处存在I/V、V/T突变.采用Discovery Studi0 2.5对蛋白三维结构进行分析,结果表明AA-35的229位的缬氨酸为底物丙二酰辅酶A的结合位点.MEGA 5.0同源性分析表明甘草CHS亲缘关系良好,与其他物种区分度良好.本文筛选获得了黄酮高/低含量组甘草样品的特异CHS基因型,对于指导优质甘草的分子育种具有重要意义.

黄酮类化合物特别是查尔酮类如羟基红花黄色素A、红花红色素等是红花的主要药效成分,研究红花黄酮类的生物合成途径,对于定向调控红花的品质具有重要意义.作为调控黄酮类成分合成的入口酶,查尔酮合酶(CHS)在黄酮类化合物的合成过程中起着重要作用.但到目前为止,CHS在红花黄酮类化合物生物合成过程中的作用尚不十分清楚.茉莉酸甲酯JA/MeJA作为植物信号调节物质可以激活植物体内CHS基因表达.本研究在前期阐明红花的1个CHS基因CtCHS1功能的基础上,作为延续性工作,继续对红花中的其他CHS基因CtCHS2和CtCHS4进行研究.应用MeJA刺激花冠,分别于刺激后0、3、6、12h不同时间点采用qRT-PCR法分析CtCHS2和CtCHS4的相对表达量,采用UHPLC/Q-TOF-MS技术分析红花中次生代谢产物的变化.结果表明,CtCHS4的表达量响应MeJA的诱导在3、6h均明显升高,而CtCHS2的表达量则在诱导后表现出降低的趋势;同时,MeJA诱导后,芦丁、羟基红花黄色素A、D-苯丙氨酸、山柰酚-3-O-β-芸香糖苷、红花红色素的积累量明显提高,特别是羟基红花黄色素A的积累量在诱导后3、6、12h均显著性的提高(P≤0.05或0.01),而对山柰酚、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、槲皮素-3-β-D-葡糖苷的积累量的影响则不明显.Pearson相关分析结果表明,羟基红花黄色素A、红花红色素的积累量与CtCHS4的表达量均呈显著性正相关(r≥0.8).提示CtCHS4可能是形成羟基红花黄色素A和红花红色素的关键基因,在红花查尔酮类成分的积累中起着重要作用.CtCHS4-pMAL-C5X重组质粒在BL21 (DE3) PlyS原核表达宿主菌中成功表达出CtCHS4活性蛋白,在体外催化底物香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成了产物柚皮素.本研究结果进一步完善了红花中CHS基因的功能,为最终阐明红花查尔酮类化合物生物合成途径的关键基因积累了资料.

为探究不同温度培养对黄芩愈伤组织生长过程中黄芩苷含量及基因相对表达量的影响,该研究设置4个培养温度对黄芩愈伤组织暗培养40 d,每5d取样1次,测定生长量和黄芩苷含量,并以18S RNA为内参基因,实时荧光定量PCR分析黄芩苷合成途径中5个关键酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、查尔酮合成酶(CHS)、β口-葡糖醛酸酶(GUS)、黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸转移酶(UBGAT)基因表达量.结果表明,生物量、黄芩苷含量及积累量均随温度的升高呈增加趋势,25,30℃较适宜黄芩愈伤组织生长,25℃培养30 d黄芩苷含量与积累量最高,达到2.75％和12.44 mg;15℃培养条件下C4H,CHS,GUS,UGBAT基因相对表达量较高,25℃培养30 d至35 d PAL基因相对表达量显著高于其他处理组.各关键酶基因相对表达量与黄芩苷含量的相关性随培养温度的升高,由负相关转变为正相关,25,30℃培养条件下PAL,C4H,CHS基因相对表达量与黄芩苷含量达到极显著或显著水平.相对低温条件不利于黄芩愈伤组织生长和黄芩苷的积累,合成途径的上游酶基因PAL,C4H对黄芩苷的积累作用显著.

目的:研究艳山姜叶的化学成分.方法:采用硅胶柱色谱、MCI、Sephadex LH-20凝胶色谱及聚酰胺柱色谱对艳山姜叶的95％提取物进行分离纯化,运用NMR、MS及文献对照对所得到的化合物进行结构鉴定.结果:从艳山姜叶中分离得到10个化合物,分别鉴定为:二氢-5,6-去氢醉椒素(1)、紫云英苷(2)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)、1,2-di-O-octanoly-3-O-(6-O-α-D-galactopyranosyl-β-D-galactopyranosyl)-sn-glycerol(4)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(5)、4',6'-二羟基-2'-甲氧基二氢查尔酮(6)、小豆蔻明(7)、anibadimer A(8)、1-p-menthene-3,6-di01(9)、β-谷甾醇(10).结论:其中,化合物3～5、8和9为首次从该植物中分离得到.

目的:建立同时测定乌拉尔甘草与光果甘草药材中甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草查尔酮A含量的高灵敏度、高效率分析方法.方法:以市售乌拉尔甘草、光果甘草为实验材料,采用UPLC法对样品中7个黄酮类成分进行测定.使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μtm),以乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱,流速为0.3mL· min-1,检测波长分别为276 nm(检测芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素)、360 nm(检测异甘草苷、芹糖异甘草苷)、370 nm(检测异甘草素)、380 nm(检测甘草查尔酮A),柱温40℃.结果:甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草查尔酮A分离度良好,回归方程分别为Y=1.244 4×107X+2.511 4×102(r=0.999 9)、Y=2.676 2×107X+1.115 6×102(r=0.999 1)、Y=7.014 4×106X+8.672 4×103(r=0.996 7)、Y=1.532 8×107X +8.844 9×102(r=0.998 8)、Y=5.435 8×106X-2.554 9×103(r=0.998 7)、Y=1.227 8×107X-5.843 0×102(r=0.999 9)和Y=1.542 0×107X-2.888 4×103(r=0.996 4),线性范围分别为0.713～7.13 μg、0.078 2～0.782 μg、13.5～135 μg、2.08～20.8 μg、8.04～80.4 μg、3.15～31.4 μg、0.858～8.58 μg,检测下限和定量下限依次为1.43 ng和3.57 ng、0.019 4 ng和0.155 ng、0.172 ng和0.515 ng、0.078 3 ng和0.235 ng、0.211 ng和0.676 ng、0.120 ng和0.361 ng、0.182 ng和0.608 ng.本方法灵敏度、精密度、准确性、重复性、回收率、耐用性均良好.乌拉尔甘草中,除甘草查尔酮A含量为(0.171±0.070) mg· g-1外,其他6个成分的含量[甘草素(0.399±0.164) mg· g-1、异甘草素(0.131±0.061) mg·g-1、甘草苷(7.116±2.515)mg·g-1、异甘草苷(0.948±0.366) mg· g-1、芹糖甘草苷(4.933±1.873) mg· g-1、芹糖异甘草苷(1.193 ±0.672)mg· g-1]均高于光果甘草样品中相应成分的含量[(0.276±0.127)、(0.105±0.041)、(4.342±1.167)、(0.568±0.262)、(4.706±0.808)、(1.031±0.437)]mg·g-1.甘草素与异甘草素、芹糖甘草苷与芹糖异甘草苷的含量在2种基原甘草样品中均有显著的相关关系(P＜0.01).结论:本文运用UPLC梯度洗脱方法建立了同时测定甘草药材中7个黄酮类成分含量的方法,为甘草药材质量标准的制定以及质量评价提供参考.

花色苷是类黄酮家族中重要的一类次生代谢产物,对果实呈色起重要作用.CHS(查尔酮合成酶)和CHI(查尔酮异构酶)为花色苷合成提供了前体物质,是花色苷合成所不可或缺的.利用RT-PCR和RACE方法,本研究从石榴果皮中克隆了与花色苷合成相关的CHS基因和CHI基因的cDNA全长,同时采用qRT-PCR研究了这两个基因在三个不同色泽石榴品种‘红宝石’、‘水晶甜’、‘墨石榴’发育期内的表达模式,并分析了果皮花色苷含量变化与基因转录水平的关系.结果 表明,石榴中CHS和CHI基因cDNA全长分别为1 197bp和693 bp,分别编码398和230个氨基酸,命名为PgCHS和PgCHI,在GenBank中的登录号分别为KF841615和KF841616.在氨基酸水平上,PgCHS与荔枝、葡萄、山竹等果树的同源性达到90％以上.PgCHI与果树中龙眼、梨、美洲葡萄、桑树等同源性达到70％以上.qRT-PCR结果显示,CHS和CHI基因的表达模式随色泽发育期和品种不同而有差异.在‘红宝石’石榴中,该两个基因都有前期和后期两个表达高峰期;而‘水晶甜’石榴中这两个基因的表达高峰期均出现在中后期;‘墨石榴’发育初期时CHS和CHI的表达量最高,以后的表达量都较低.同一品种内,CHS和CHI的表达具有协同性,两者的协同性表达有利于花色苷及其他类黄酮相关产物的合成.3个品种中CHS和CHI基因的表达与花色苷的积累并不一致.

为探究羊角天麻(Dobinea delavayi)的β-羟高铁血红素形成抑制活性成分,本实验采用硅胶、Sephadex LH-20柱色谱等方法进行化合物的纯化分离,通过理化性质及波谱数据鉴定化合物结构.结果 从羊角天麻中分离得到12个化合物,分别鉴定为3,4,2',4'-四羟基二氢查尔酮(1)、紫铆花素(2)、3,4,2',4',α-五羟基查尔酮(3)、金色草素(4)、芒果苷(5)、没食子酸(6)、二十四亚甲基环阿尔廷醇(7)、6β-羟基-豆甾-4-烯-3-酮(8)、β-谷甾醇(9)、胡萝卜苷(10)、棕榈酸甲酯(11)、1-棕榈酸单甘油酯(12),其中化合物1～4、6～8均为首次九子母属植物中分离得到.活性研究结果显示,化合物1～6均具有β-羟高铁血红素形成抑制活性,其中黄酮类化合物2～4具有较强的抑制活性,其IC50分别为120.3、61.5、56.0 μg/mL.