[目的]本研究旨在通过建立团花绢野螟Diaphania glauculalis成虫触角转录组数据库,挖掘化学感受相关基因,为团花绢野螟成虫触角的化学感受机制及绿色防控技术提供理论基础.[方法]使用Illumina NovaSeq 6000平台对团花绢野螟成虫触角转录组进行测序,使用Trimmomatic和Trinity对测序所得的原始数据进行剪切、组装得到转录组数据;比对CDD,KOG,COG,NR,NT,PFAM和KEGG等数据库获得基因注释信息,筛选鉴定出化学感受相关基因;使用TPM(transcripts per million)评估化学感受相关基因的表达量;应用最大似然法构建团花绢野螟化学感受相关基因系统发育树.[结果]团花绢野螟雄成虫触角转录组测序获得52 705 124条unigenes,雌成虫触角转录组测序获得55 391 610条unigenes.通过与NR数据库比对注释,团花绢野螟成虫触角转录组注释unigenes共24 192条,其中与亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的同源序列最多,有10 679条.有14 313条unigenes被注释到204 289条GO功能条目,其中113 387条unigenes注释到生物学进程,70 115条unigenes注释到细胞组分,20 787条unigenes注释到分子功能.有10 721条unigenes注释到KOG数据库25个分类的11 968功能条目.有12 892条unigenes被注释到KEGG数据库5类代谢通路,归属于33个通路,其中注释到信号转导通路的unigenes最多,有1 500条unigenes,进而筛选鉴定到136个化学感受相关基因,包括31个气味结合蛋白(odorant-binding protein,OBP)基因、24 个化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因、50 个气味受体(odorant receptor,OR)基因、20个离子型受体(ionotropic receptor,IR)基因、9个味觉受体(gustatory receptor,GR)基因和2个感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因.[结论]本研究首次构建了团花绢野螟成虫触角转录组数据库,阐述了化学感受相关基因的种类和数量,为团花绢野螟化学感受基因功能分析及化学感受机制奠定分子基础,进而为基于昆虫化学感受反应机制开发新的绿色防控技术提供理论支撑.

[目的]羧酸酯酶(carboxylesterases,CCEs)是一类重要的水解酶超家族,参与昆虫体内各种外源物质的代谢过程.本研究利用不同发育阶段、不同组织和吸血前后中华按蚊Anopheles sinensis的转录组数据分析CCE基因表达模式,为进一步研究CCEs在不同生理过程中的潜在功能奠定基础.[方法]以前期从中华按蚊实验室品系转录组数据库中筛选出的50个CCE基因,利用生物信息学分析其在中华按蚊不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫、雄蛹、雌蛹、雄成蚊和雌成蚊)、成蚊不同组织(触角、唾液腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、表皮和脂肪体)中以及雌成蚊吸血前和吸血后不同时间(1,3,6,12,24和48 h)的表达模式.[结果]CCE基因主要在幼虫或成蚊阶段高表达或特异性表达;AsAe12,AsAe4和AsBe4在所有发育阶段均高表达.CCE基因的表达具有组织特异性,主要集中在成蚊触角、表皮和精巢中表达;此外,5个CCE基因(AsAe13,AsAe12,AsAe6,AsAe4和AsBe4)在成蚊中肠、马氏管和脂肪体中均高表达,可能与这些解毒器官代谢异生物有关.在雌成蚊吸血后,大多数CCE基因的表达量发生了变化,它们的表达模式也存在差异,这表明血液消化是一个复杂的过程.[结论]本研究结果丰富了中华按蚊CCE基因的知识,为深入探究CCE家族基因在中华按蚊生长发育中的的潜在功能提供有价值的参考.

[目的]分析和阐明沟眶象Eucryptorrhynchus scrobiculatus味觉受体基因EscrGR8的分子特性和功能,揭示其调节雌成虫繁殖力的作用.[方法]基于沟眶象触角转录组数据库,采用RACE克隆EscrGR8的cDNA全长序列;利用qRT-PCR检测EscrGR8在沟眶象不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)和雌雄成虫组织(去除触角和喙的头、触角、口器、中肠、前足、睾丸、卵巢、雄虫交配器和雌虫产卵器)中的表达量.显微注射雌成虫dsRNA后0,6,12,24,36,48和72 h时利用qRT-PCR检测RNAi后EscrGR8的表达量.检测显微注射dsEscrGR8后1-5d和6-11d时沟眶象雌成虫在不同土壤含水量(0～10％,11％～20％,21％～40％,41％～60％,61％～80％和81％～100％)条件下的产卵选择率、总产卵数量和所产卵的孵化率,研究抑制EscrGR8表达对雌成虫产卵选择性和繁殖力的影响.[结果]成功克隆了沟眶象EscrGR8(GenBank登录号:OR836580)的cDNA全长序列,开放阅读框(ORF)长1 251 bp,编码了 416个氨基酸,具有6个跨膜结构域.多序列比对和系统发育进化分析结果表明,EscrGR8与其他昆虫的GR的氨基酸序列同源性普遍较低,其中与棉铃象甲Anthonomus grandis的AgraGR64f氨基酸序列一致性为30.96％.qRT-PCR检测结果表明,EscrGR8在沟眶象不同发育阶段和成虫组织中的表达量具有显著差异,EscrGR8在雌成虫中的表达量最高,在卵中的表达量最低;EscrGR8在雌成虫卵巢中特异性高表达.显微注射dsEscrGR8不仅在一定时间内显著降低EscrGR8的表达量,并且对雌成虫的产卵选择性具有显著影响.显微注射dsEscrGR8后1-5 d时沟眶象雌成虫在含水量21％～40％土壤条件下的产卵选择率和所产卵的孵化率与显微注射dsGFP的对照组相比分别显著降低了 24.66％和15.83％;在含水量81％～100％土壤条件下的产卵选择率与显微注射dsGFP的对照组相比显著增加了 28.39％,雌成虫所产卵几乎不孵化.[结论]本研究证实了味觉受体基因EscrGR8对沟眶象雌成虫产卵选择和繁殖力的影响,有助于理解昆虫味觉受体基因的多样性和功能特异性.

[目的]基于粘虫Mythimna separata成虫脑转录组数据,明确粘虫体内生物胺受体基因的分子特征及组织表达特性,为粘虫生物胺受体基因的功能研究提供基础.[方法]从粘虫成虫脑转录组数据库中筛选生物胺受体基因序列;基于粘虫基因组数据库,对筛选到的生物胺受体进行基因定位;利用最大似然法对鉴定到的生物胺受体进行系统发育分析;利用qRT-PCR检测鉴定到的生物胺受体基因在粘虫雌雄成虫脑、触角、下唇须、翅、足、胸和腹中的表达量.[结果]从粘虫成虫脑转录组数据库中鉴定出17个生物胺受体基因,包括5个多巴胺受体基因、5个5-羟色胺受体基因、5个章鱼胺受体基因和2个酪胺受体基因.这17个生物胺受体基因分布于8条染色体上,其中7个受体基因共定位于22号染色体上.鉴定到的粘虫生物胺受体与斜纹夜蛾Spodoptera litura、家蚕Bombyx mori和烟草天蛾Manduca sexta生物胺受体具有较高的同源性.粘虫多巴胺受体基因均在雌雄成虫脑和触角中高表达,其中MsepDop2,MsepDop3-1,MsepDop3-2和MsepDopEcR在雌成虫脑中的表达量显著高于在雄成虫脑中的表达量;章鱼胺受体基因MsepOA1和MsepOA2B2在胸部高表达,且在雌成虫胸部中的表达量显著高于雄成虫胸部中的,MsepOA3和MsepOA2B1-3在嗅觉组织触角和下唇须中也具有较高的表达量,并且表达量具有性别差异;酪胺受体基因在脑和触角中具有较高的表达量,其中MsepTA2在雌成虫腹部中的表达量显著高于雄成虫腹部中的;Msep5-HT1基因在脑部中的表达量显著高于在其他组织中的,Msep5-HT2基因在脑、触角和下唇须中都具有较高的表达量.[结论]本研究获得了粘虫17个生物胺受体基因,明确了其在雌雄成虫不同组织中的表达模式,并发现部分生物胺受体基因在粘虫嗅觉和生殖组织中的表达具有性别差异,这为进一步研究粘虫生物胺受体的生理功能提供了基础.

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响.本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性.结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异.不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据.

[目的]探讨东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis Wnt基因家族中WntA编码蛋白序列特征及其在胚胎发育阶段的时空表达谱,为进一步开展LmmWntA的功能研究及挖掘东亚飞蝗其他Wnt基因家族成员奠定基础.[方法]PCR克隆并利用邻接法(neighbor-joining,NJ)鉴定东亚飞蝗Wnt基因家族基因LmmWntA;通过同源序列多重比对分析LmmWntA氨基酸序列特征;利用整胚原位杂交技术对LmmWntA在东亚飞蝗产卵后(after egg laying,AEL)发育至12,24,35,46,56和65 h以及3,3.5,4,4.5,5,5.5,6.5,8,8.5,9.5和11 d共17个连续胚胎发育阶段进行转录信号筛查.[结果]克隆获得东亚飞蝗LmmWntA(GenBank登录号:MW052768),CDS全长1 101 bp,编码336个氨基酸;LmmWtnA与头索动物、昆虫、有爪动物及环节动物WntA蛋白共同聚为WntA亚家族单系群;LmmWntA中段和C端与比对物种WntA蛋白序列保持了较高同源性,仅在N端信号肽区域出现差异,LmmWntA与膜翅目(Hymenoptera)西方蜜蜂Apis mellifera AmWntA蛋白聚为姊妹群,氨基酸序列一致性为59.05％.LmmWntA最先表达在东亚飞蝗35 h AEL胚胎期末端生长区并在该区域持续表达至4 d AEL胚胎期,同时在新生体节每节腹部形成条纹状表达;在46 h AEL胚胎期视叶后半区持续表达至8.5 d AEL胚胎期,该区域未来发育成复眼;在56 h AEL胚胎期脑持续表达至5.5 dAEL胚胎期;在65 hAEL胚胎期每节腹部的条纹状表达信号逐渐转移至腹中线两侧,在触角基部有明显的表达信号;在5.5 d AEL胚胎期表达信号进一步转移至腹神经;从3 d AEL胚胎期开始在腹侧体节远轴端表达,后期转移至上颚、足关节及末端;伴随4.5 d AEL胚胎末端开始内陷形成肛道,LmmWntA在内陷肛道的腹面及前端表达,最多内陷至腹部第7体节;至9.5 d AEL胚胎期时LmmWntA在翅芽盘处表达.[结论]LnmWntA在东亚飞蝗胚胎发育阶段动态表达,推测LmmWntA参与东亚飞蝗胚胎后端体节生长、神经系统(脑和腹神经)、复眼、触角、消化系统后端(肛道)、颚、胸部附肢(足和翅)等重要组织和器官的发生和形成.本研究结果为进一步开展LmmWntA功能缺失研究奠定发育生物学基础.

[目的]本研究旨在筛选西方蜜蜂Apis mellifera采集蜂咽下腺中高表达的基因,为进一步筛选和研究蜜蜂采集行为相关基因提供依据.[方法]基于前期已获得西方蜜蜂3日龄工蜂(3d_W)、10日龄哺育蜂(10 d_N)、10日龄采集蜂(10 d_F)、21日龄哺育蜂(21 d_N)和21日龄采集蜂(21 d_F)的咽下腺转录组数据,筛选咽下腺差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并对10日龄和21日龄采集蜂咽下腺中高表达的DEGs进行GO和KEGG富集分析;利用qPCR检测西方蜜蜂采集蜂咽下腺中高表达的4个DEGs(LOC409889,LOC406114,LOC408453和LOC100578735)在不同发育时期(卵、幼虫、蛹、刚出房工蜂、10日龄哺育蜂和21日龄采集蜂)和21日龄采集蜂组织(腹、胸、触角、上颚腺、咽下腺、蛰针、足、肠道、翅和脑)中的表达量.[结果]比较转录组结果表明,164个上调表达的DEGs在21日龄采集蜂咽下腺中的表达量明显高于在3日龄工蜂、10日龄哺育蜂和21日龄哺育蜂咽下腺中的表达量,且在10日龄采集蜂咽下腺中的表达量也高于在10日龄哺育蜂咽下腺中的表达量;105个下调表达的DEGs的表达趋势与上述164个DEGs的相反.GO分析结果表明,10日龄和21日龄采集蜂咽下腺中高表达的164个DEGs显著富集于硫酸盐跨膜转运蛋白活性、硫化合物跨膜转运蛋白活性、铁离子结合和氧化还原酶活性;下调表达的105个DEGs显著富集于核糖体、细胞内核糖核蛋白复合物和核糖核蛋白复合物;KEGG通路分析结果表明,105个下调表达的DEGs显著富集于核糖体以及淀粉和蔗糖代谢两个通路.qPCR 检测结果显示,LOC409889,LOC406114,LOC408453 和 LOC100578735 均在 21 日龄采集蜂中表达量最高;LOC406114和LOC100578735在21日龄采集蜂咽下腺中的表达量最高,而在其他组织中表达量较低或不表达.[结论]本研究通过比较转录组筛选鉴定了西方蜜蜂采集蜂咽下腺中高表达的DEGs,为深入研究采集蜂咽下腺的功能提供了数据,同时也为研究西方蜜蜂的采集行为及采集力强蜂种的分子选育提供新的视角.

[目的]本研究旨在为深入研究梨小食心虫Grapholita molesta尼曼-匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 protein,NPC2)GmolNPC2的嗅觉感受功能提供理论参考.[方法]基于梨小食心虫触角转录组数据,利用RT-PCR扩增GmolNPC2的cDNA全长序列,进行系统进化分析和3D结构模型预测;利用RT-qPCR检测GmolNPC2在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和雌雄成虫)、3日龄雌雄成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足和翅)中的相对表达量;利用荧光竞争结合实验测定重组GmolNPC2蛋白对包括6种性信息素和38种寄主植物挥发化合物在内的44种气味配体的抑制常数Ki 值,分析结合能力;通过分子对接模拟实验计算GmolNPC2与不同气味配体的结合能,预测蛋白和配体相互作用的关键氨基酸残基.[结果]获得梨小食心虫GmolNPC2(GenBanK登录号:OQ054801)的cDNA全长序列,开放阅读框(ORF)长438 bp,编码145个氨基酸;多序列比对发现GmolNPC2具有昆虫NPC2典型的结构特征;系统进化分析表明已知鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的 NPC2s 聚类至 2 个分枝,GmolNPC2 与大豆食心虫 Leguminivora glycinivorella、红铃虫Pectinophora gossypiella和烟草天蛾Manduca sexta等的NPC2氨基酸序列一致性较高并聚类至同一分枝.RT-qPCR检测结果表明,GmolNPC2在梨小食心虫雄成虫和卵中的表达量显著高于其他发育阶段的;GmolNPC2在3日龄雌雄成虫翅中的表达量最高,在触角中的次之,在胸、腹和足中的最低.重组蛋白GmolNPC2的结合谱较窄,仅能够结合44种气味配体中的17种,对其中的乙酸-顺-8-十二碳烯酯、苯甲醇和乙酸-顺-3-己烯酯表现出强烈的结合能力,Ki 值分别为(4.117± 0.046),(4.845±0.079)和(3.979±0.167)μmol/L.分子对接模拟结果显示,GmolNPC2 与不同气味配体之间的结合能存在差异,与上述荧光结合实验的结果较一致.疏水性氨基酸残基和氢键在GmolNPC2结合不同气味配体中发挥着重要作用.[结论]GmolNPC2具有昆虫NPC2家族的保守结构,在卵和成虫以及成虫翅和触角中的表达量较高,推测其参与梨小食心虫的多种生理过程.重组蛋白GmolNPC2能够选择性地结合性信息素和寄主植物挥发化合物,表明GmolNPC2参与对挥发性信息物质的识别和运输.

[目的]建立菜粉蝶Pierisrapae成虫触角转录组数据库,利用生物信息学和分子生物学手段深入挖掘菜粉蝶基因数据信息.[方法]采用高通量测序平台(Illumina NovaSeq 6000)对菜粉蝶成虫触角进行转录组测序、序列组装、功能注释及差异表达基因分析,对PrapOR1,PrapOR2,PrapOR5,PrapOBP1,PrapOBP4,PrapOBP5,PrapSNMP1,PrapSNMP2 和 PrapSNMP3 9 个差异表达的嗅觉相关基因进行qRT-PCR验证.[结果]菜粉蝶成虫触角转录组共获得17.65 GB测序数据(NCBI登录号:PRJNA869896),经过滤和序列拼接共得到116 317条转录本,随后进行Corset层次聚类获得43 390条unigene,经BUSCO评估,拼接质量完整度好,准确性高.注释到的unigene数目从大到小排列的数据库依次为NT,NR,Pfam,GO,Swiss-Prot,KEGG和KOG/COG;进一步进行基因功能注释分析,筛选得到176个嗅觉相关基因,其中19个基因差异表达,包括在雌成虫触角中高表达的15个基因和在雄成虫触角中高表达的4个基因.qRT-PCR验证结果表明,PrapOR1和PrapOR2 在雄成虫触角中高表达,PrapOR5,PrapOBP1,PrapOBP4,PrapOBP5,PrapSNMP1,PrapSNMP2和PrapSNMP3在雌成虫触角中高表达,与转录组测序结果相符.[结论]本研究建立了菜粉蝶成虫触角转录组数据库,筛选得到了嗅觉相关基因,并对嗅觉相关基因进行了差异表达分析,研究结果为进一步研究菜粉蝶的基因功能及嗅觉分子机制奠定了理论基础.

家蚕头部是一个神经中枢和感受的器官,其头部含有触角和感觉毛,感受外界的信号,并将外界信号传送到大脑进行反应.保幼激素主要是由咽侧体合成和分泌的,而保幼激素结合蛋白是保幼激素转运和发挥功能的载体,在昆虫体内具有极其重要的功能.文中通过SilkDB和NCBI数据库筛选并鉴定到一个新的具有保幼激素结合蛋白家族保守结构的蛋白BmTOL,其编码基因编号为BGIBMGA003404 (GenBank登录号:KY681053).利用原核表达系统成功表达了该蛋白,通过Ni-NTA亲和层析的方法获得了BmTOL的重组蛋白并制备了多克隆抗体.组织表达分析发现无论是转录水平还是蛋白水平BmTOL在头部都是高量表达,且Bmtol基因在起蚕时表达量较高,在5龄和蛹期表达量较低,而在化蛾后表达量又开始上调.免疫组化结果显示BmTOL蛋白定位在头部的皮层、触角和脑中,推测其可能与头部信息传递有关,为家蚕的生长发育和行为调控提供重要的信息来源.