目的:分离可裂解烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体，研究其生物学特性、基因组信息及对细菌生物膜的作用。方法:(1)2018年，取分离自上海交通大学医学院附属瑞金医院(下称瑞金医院)烧伤患者血液的泛耐药肺炎克雷伯菌UA168(下称宿主菌)液，采用污水共培养法及滴板法和双层琼脂平板法，从瑞金医院污水中分离纯化得到烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，将其命名为噬菌体KP168，观察其噬菌斑形态。(2)取噬菌体KP168液行氯化铯密度梯度离心和透析后，采用磷钨酸负染法通过透射电子显微镜观察噬菌体KP168形态。(3)取噬菌体KP168液，采用滴板法检测其对从瑞金医院烧伤患者血液中分离得到的20株泛耐药肺炎克雷伯菌的裂解能力，计算裂解率。(4)分别以感染复数为10.000、1.000、0.100、0.010和0.001共同常规振荡培养初始效价为9.3×10 11噬菌斑形成单位(PFU)/mL噬菌体KP168液(每管400 μL)和浓度为1×10 9集落形成单位(CFU)/mL宿主菌液(每管4 mL)4 h(每种感染复数1管)，采用双层琼脂平板法测算噬菌体KP168效价(测算方法下同)以筛选最佳感染复数，实验重复3次。(5)以感染复数为0.005混合浓度为1×10 9 CFU/mL宿主菌液(每管4 mL)和效价调整为5×10 7 PFU/mL噬菌体KP168液(每管400 μL)，分别于混合后0(即刻)、1、2、3、4、5、15、30 min(每个时间点1管)采用双层琼脂平板法计数噬菌斑(计数方法下同)，计算已吸附噬菌体百分比以筛选最佳吸附时间，实验重复3次。(6)以感染复数为0.005混合浓度为1×10 9 CFU/mL宿主菌液(每管300 μL)和效价调整为5×10 8 PFU/mL噬菌体KP168液(每管60 μL)，静置最佳吸附时间后常规振荡培养，分别于培养0(即刻)、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min测算噬菌体KP168效价，绘制一步生长曲线，实验重复3次。(7)取效价为2.5×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液，分别于37、40、50、60、70 ℃静置培养1 h(每个时间点3管，每管1 mL)，计数噬菌斑并绘制热稳定曲线。取效价为3.0×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液，分别加入pH值为5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、10.0的SM缓冲液于37 ℃静置培养1 h(每种pH值3管，每管含100 μL噬菌体KP168液、900 μL SM缓冲液)，计数噬菌斑并绘制酸碱稳定曲线。(8)取噬菌体KP168液同实验(2)透析后行DNA抽提与测序，用Prokka对全基因组进行注释以获得噬菌体KP168编码序列，使用Nucleotide BLAST功能进行核酸序列比对以寻找与噬菌体KP168核酸序列相似度最高的已知噬菌体，使用Blastx功能将编码序列翻译成蛋白质后进行功能预测，比对抗性基因数据库和毒力因子数据库。(9)于96孔板中，分别以感染复数为1.000、0.100、0.010和0.001，在浓度为1.5×10 8 CFU/mL(浓度下同)的200 μL宿主菌液中加入初始效价为5.8×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液20 μL(每种感染复数3孔)共同培养48 h；将200 μL宿主菌液静置培养48 h后，分别加入效价为1×10 6、1×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10 PFU/mL的噬菌体KP168液20 μL(每种效价3孔)静置作用4 h。2种实验均以200 μL宿主菌液中加入SM缓冲液20 μL(3孔)为阴性对照，以220 μL LB培养液(3孔)为空白对照，均采用酶标仪测定吸光度值并分别计算生物膜抑制率和生物膜破坏率，实验均重复3次。 结果:(1)成功分离纯化噬菌体KP168，其噬菌斑透亮，呈圆形，直径约1.5 mm。(2)噬菌体KP168呈正多面体结构，直径约为50 nm，无尾部结构。(3)噬菌体KP168可裂解20株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌中的13株，裂解率为65.0%。(4)感染复数为1.000时，噬菌体KP168与宿主菌共同培养4 h后，效价最高，以此为最佳感染复数。(5)噬菌体KP168与宿主菌混合后4 min，已吸附噬菌体百分比最高，以此为最佳吸附时间。(6)一步生长曲线表明噬菌体KP168裂解宿主菌时，潜伏期约10 min，裂解期约40 min。(7)噬菌体KP168在40 ℃、pH值为7.4时，噬菌斑数最多，活性最大。(8)噬菌体KP168基因组是线状双链DNA，长度为40 114 bp；有48个可能编码序列；与Klebsiella phage_vB_Kp1相似度最高；编码序列翻译蛋白对应的已知最相似蛋白中包含23个假设蛋白和25个已知功能蛋白；未见抗性基因和毒力因子基因；获得GeneBank登录号MN585130。(9)以各感染复数共同培养噬菌体KP168与宿主菌48 h后，生物膜抑制率相近，平均约为45%；效价为1×10 9 PFU/mL噬菌体KP168作用于宿主菌已形成的生物膜4 h后，生物膜破坏率最高，达平均42%。 结论:本研究自污水中分离得到1株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体——噬菌体KP168，该株噬菌体属于无尾科噬菌体，宿主谱宽、吸附时间短、潜伏期短，具有一定的热和酸碱稳定性；其基因组信息明确，不含抗性基因及毒力因子基因；对细菌生物膜的形成有抑制作用，对已形成的细菌生物膜有破坏作用。

目的:评估三氯甲烷抽提冻融细胞沉淀内腺病毒颗粒的效果，建立一种提高氯化铯垫层超速离心纯化腺病毒产量的方法。方法:收集感染腺病毒的HEK293细胞，反复冻融3次,离心后分别收获细胞冻融后上清及细胞残渣，使用三氯甲烷抽提细胞残渣内病毒颗粒，通过氯化铯密度梯度超速离心法纯化腺病毒。通过透射电子显微镜技术评价三氯甲烷抽提腺病毒的效果，通过分光光度计法及测定病毒感染滴度分析获得纯化腺病毒产量及活性。结果:三氯甲烷可促进冻融细胞残渣内病毒颗粒释放，增加约34%病毒产量，且三氯甲烷抽提获得的腺病毒形态完整、活性良好。结论:建立了一种通过三氯甲烷抽提细胞残渣增加腺病毒超速离心纯化产量的方法，为提高腺病毒纯化效率提供参考，以期满足科研需求。

目的 建立原子吸收分光光度法测定注射用哌拉西林钠中钠含量,同时对国产制剂成盐情况进行评价.方法 原子吸收分光光度法(atomic absorption spectrophotometry,AAS).采用钠元素空心阴极灯光源;空气-乙炔火焰原子化器;检测波长589.0 nm;4％氯化铯溶液作为电离抑制剂,临用稀释50倍.结果 原研企业4批次样品中钠含量平均值4.46％,16家国内生产企业204批次样品中钠元素含量平均值4.41％,均高于理论值4.26％,不同生产企业的产品钠含量差异大,多批次超出理论值±5％范围.结论 该方法操作简单、专属性强、结果准确,可通过钠含量的测定,对哌拉西林钠原料成盐工艺水平进行评估.

[背景]人源诺如病毒是急性胃肠炎暴发的主要原因,GII.4 是过去几十年的主要流行基因型.2014/2015 年出现的GII.17 型变异株是中国首例导致大规模暴发的非GII.4 流行株.通过对来自华南地区的诺如病毒GII.17 型毒株的完整基因组序列进行分析,证实了该GII.17 型突变株与先前确定的GII型变异株不同.[目的]制备广州地区GII.17 型诺如病毒GZ-L343 的病毒样颗粒,并系统表征其免疫原性及功能特性.[方法]借助杆状病毒表达系统制备GII.17-GZ-L343 的病毒样颗粒,并通过氯化铯梯度超速离心对其进行纯化,制备抗血清并对其免疫功能进行评价.[结果]聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹结果表明所得蛋白分子量大小约为 58 kDa;透射电镜结果表明病毒样颗粒直径约为 30 nm;酶联免疫吸附测定结果显示该病毒样颗粒具有较好的免疫原性;唾液组织血型抗原的体外受体结合测定表明,该病毒样颗粒与部分A型、B型、O型及AB型分泌及非分泌血型样本存在阳性结合;效价测定结果表明免疫所得血清效价在 104 以上;交叉反应结果表明该抗血清与异型病毒样颗粒不存在交叉反应.此外,体外阻断结果表明,该抗血清仅能阻断相应型别病毒样颗粒与受体的结合作用,与异型病毒样颗粒不存在交叉阻断.[结论]GII.17-GZ-L343 具有广泛的结合谱,其抗血清对异型病毒样颗粒不具有广谱性,且只对同型病毒样颗粒存在阻断作用,结果将为进一步揭示该病毒的宿主适应特性、进化机制及研发多价疫苗提供理论支持.

目的 筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)融合前构象F蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus,rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础.方法 在真核表达载体pcDNA3.1(+)上插入具有不同突变位点的HRSV F蛋白编码序列,利用融合前F蛋白单克隆抗体AM14和D25筛选HRSV F蛋白突变体;通过同源重组将筛选出的前构象F蛋白突变体编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,在HEK293细胞中进行重组病毒的包装和扩增,经氯化铯密度梯度法获得纯化的重组病毒;应用夹心ELISA法和Western blot鉴定F蛋白的表达及构象.结果 通过AM14和D25单克隆抗体筛选出了 2个稳定维持在融和前构象的HRSV F蛋白序列(SC-3M和SC-5M).将SC-3M和SC-5M编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,对两种重组人5型腺病毒(pAd5-SC-3M 和 pAd5-SC-5M)和空载体(pAd5-vector)纯化,病毒滴度分别达到 2.016 × 1010,2.52 × 1010和 2.948× 1011 IU/mL.pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M感染HEK293后均能高效表达HRSV融合前构象的F蛋白并维持三聚体结构,且pAd5-SC-5M感染细胞中F蛋白表达量高于pAd5-SC-3M.结论 成功在体外传代细胞中获得可高效表达A型HRSV融合前F蛋白的重组人5型腺病毒,为进一步通过动物试验评价该HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定了基础.

目的:针对目前检测领域缺乏诺如病毒(Norovirus,NoV)核酸标准样品这一瓶颈,基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术构建内含GII型NoV检测靶标RNA的病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)标准参考样品.方法:人工合成包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、ISO/T15216-2 2012中规定的GII型NoV检测靶标对应的cDNA序列及辅助多克隆位点的DNA片段QINVGII,将其克隆到pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-QINVGII.将pET-QINVGII转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和透射电镜分析后,利用氯化铯密度梯度离心,制备纯化VLPs,并对纯化后的VLPs开展均匀性、稳定性及定值研究.结果:SDS-PAGE结果证实重组大肠杆菌在14.lkDa左右有目的条带表达;透射电镜下可观察到大量结构完整、直径约为25nm的VLPs.定值结果显示,制备的VLPs样品中GII型NoV检测靶标RNA的含量为(1.06 ±0.06)×107 copies/μl;均匀性分析结果表明样品均匀性良好,即F=2.24＜ F0.05(9,20);稳定性结果表明,制备的VLPs在37℃可保存12天、室温(20 ～25℃)可保存24天、4℃至少可保存90天、-20℃至少可保存200天、-80℃至少可保存300天.结论:基于Qbeta噬菌体制备的NoV装甲RNA均匀性和稳定性良好,拷贝数高,为NoV分子检测提供了良好的标准参考样品.

目的 扩增微小隐孢子虫卵囊并筛选其纯化方法,以期获得大量有活性的纯净微小隐孢子虫卵囊. 方法 将微小隐孢子虫分离株人工感染犊牛,分别采用饱和蔗糖溶液漂浮法、饱和盐水漂浮法、饱和硫酸锌漂浮法浓集粪便中的卵囊,经氯化铯密度离心纯化后,用脱囊率进行纯化卵囊的活力检测. 结果 3种卵囊浓集方法中,饱和食盐水漂浮法所获得的卵囊杂质少,显微镜下视野干净,经氯化铯密度离心后获得清晰的卵囊带卵囊量为3.5×108个,其中76％的卵囊保持良好活力. 结论 饱和盐水漂浮再结合氯化铯密度离心获得微小隐孢子虫卵囊纯度高、活性良好,可作为实验室批量分离纯化微小隐孢子虫卵囊的首选方案.

目的 基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含A群轮状病毒(Rotavirus,RV)检测靶标的装甲RNA(Rotavirus armored RNA,AR-RV),并开展系统的初步定值、均匀性、稳定性研究.方法 人工合成核酸片段QβSNRV,该片段5'端至3'端依次为Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列、RV检测靶标cDNA序列、多克隆位点序列,并将其克隆到pET-28a(+)载体中构建重组质粒pET-QβSNRV.将pET-QβSNRV转化大肠埃希菌BL21 (DE3)并诱导表达,利用氯化铯密度梯度超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析纯化AR-RV后电镜观察,并参照GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》规定的方法与原则对制备的AR-RV开展定值、均匀性和稳定性研究.结果 十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果证实重组质粒在大肠埃希菌中有目的条带表达,大小约为14.1 kDa;经氯化铯密度梯度超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析纯化的AR-RV无杂蛋白干扰;电镜下可见结构完整的病毒样颗粒,大小约为25 nm;定值结果显示,AR-RV中检测靶标RNA的含量为(1.02±0.3)×107 copies/μl;均匀性分析结果为F=0.66＜F005(9.20),表明样品均匀性良好;稳定性结果表明,AR-RV在37℃可保存15d、25℃可保存15d、4℃可保存50 d、-20℃至少可保存270 d、-80℃至少可保存360 d.结论 本研究基于Qβ噬菌体制备的AR-RV拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为RV分子检测提供安全、稳定的标准参考样品.

目的 利用昆虫细胞表达体系制备人乳头瘤病毒(HPV)31 L1病毒样颗粒(VLP)疫苗.方法 化学合成法获得昆虫Sf9细胞偏性密码子优化的、C端删除27个氨基酸编码序列的HPV31 L1截短基因( HPV31 L1MΔC),构建重组杆状病毒,感染Sf9细胞进行表达;分别采用超声破碎、含离子型表面活性剂(1% SDS等)或含非离子型表面活性剂(0. 5% TritonX-100)的裂解缓冲液,制备细胞裂解上清;氯化铯超速离心法纯化后经动态光散射及透射电子显微镜鉴定;0. 1 μg的HPV31 L1MΔC VLP于第0和2周肌肉免疫BALB/c小鼠,第4周采集血清分析中和活性.结果 3种裂解方法制备的上清均显示HPV31 L1MΔC蛋白的特异表达,其表达量约占裂解上清总蛋白的10%;采用非离子型表面活性剂获得的裂解上清纯化后,目的蛋白纯度高,产量达11. 5 mg/L;纯化蛋白的水化分子直径为103. 3 nm,均一性好;电镜分析为直径50~60 nm的VLP.免疫血清中HPV31中和抗体滴度为1 440.结论 HPV31 L1MΔC在昆虫细胞表达体系制备的VLP产量高、免疫原性好,可用于生产含HPV31 L1 VLP的多价疫苗.

目的 制备抗CA16病毒的特异性单克隆抗体,评价单克隆抗体在ELISA和细胞免疫化学染色中的作用,并利用单抗建立CA16快速检测胶体金免疫层析法并对其进行初步评价.方法 CA16病毒接种RD细胞大量培养,氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒颗粒,透射电镜鉴定纯化产物.福尔马林灭活病毒颗粒后免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术制备稳定分泌抗CA16单抗的杂交瘤细胞株.ELISA和免疫荧光试验分别对单抗特性进行分析.根据单抗反应特性,分析单抗在细胞ELISA、细胞免疫组化中的应用,并利用特异性抗CA16单抗建立CA16胶体金免疫层析快速检测法.结果 氯化铯密度梯度离心纯化病毒颗粒电镜观察显示,病毒颗粒为二十面体立体对称球形结构,大小均匀.经免疫小鼠,获得1株稳定分泌抗CA16单克隆抗体的杂交瘤细胞株(mAb CA16-19),该单抗为IgG2a亚型,细胞免疫荧光表明,单抗与RD宿主细胞内的CA16病毒颗粒结合.细胞ELISA显示,随着病毒滴度增加吸光度也增加.细胞免疫化学染色分析表明,单抗可与CA16病毒感染的RD结合,而不与EV71感染RD细胞和正常RD细胞反应.因此,该单抗可用于细胞ELISA和细胞免疫化学染色.同时,依据前期制备的抗CA16单抗(mAb CA16-10),并结合此次制备的mAb CA16-19共同建立胶体金免疫层析试纸条,该试纸条不与EV71和柯萨奇病毒B型交叉反应,最低检测限为6.25×106,25 TCID50/0.1 mL.结论 利用氯化铯密度梯度离心纯化出CA16病毒颗粒,筛选出1株特异性抗CA16单抗,此株单抗可用于细胞免疫荧光试验、细胞ELISA和细胞免疫化学染色试验.并以单抗为原材料建立了CA16快速检测胶体金免疫层析法,为CA16病毒感染的快速诊断提供帮助.