目的 原核表达并纯化麻疹病毒(measles virus,MV)核蛋白(N),免疫家兔后制备兔抗MV N抗血清,并鉴定其特异性.方法 以MV-S191疫苗株基因组为模板,PCR扩增N基因3个片段,构建重组表达质粒pGEX-MV-N1、pGEX-MV-N2和pGEX-MV-N3,分别转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达N-末端带有GST标签的融合蛋白GST-MV-N1、GST-MV-N2和GST-MV-N3,纯化后,分别与等体积弗氏完全佐剂(初次免疫)、弗氏不完全佐剂(加强免疫)混合,乳化均匀后各免疫1只雌性家兔,共免疫6次,采集全血,分离血清获得兔抗MV N抗血清,Western blot法及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定其特异性.结果 重组表达质粒 pGEX-MV-N1、pGEX-MV-N2 和pGEX-MV-N3经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确;表达的GST-MV-N1和GST-MV-N3融合蛋白相对分子质量分别约42 000和39 000,主要以包涵体形式存在,纯度分别为96％和85％,而上清和沉淀中均未见GST-MV-N2融合蛋白的表达;兔抗MVN3抗血清能特异性识别MV-S191感染细胞后表达的N蛋白,且特异性高于兔抗MV-N1抗血清.结论 成功制备了兔抗MV N抗血清,为重组MV疫苗的研发以及MV结构蛋白抗体的制备提供了技术支持.

目的 构建表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Omicron BA.1变异株S1蛋白的真核表达载体,在CHO-K1细胞中进行表达,评价其免疫原性,并对佐剂和抗原剂量进行研究.方法 构建重组质粒UCOE-Omi-S1,转染至CHO-K1工程细胞中进行表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blot法实验鉴定重组S1蛋白.将BALB/c小鼠随机分为12组,即 PBS组,无佐剂组(高、中、低剂量组),铝盐佐剂对照组,MF59佐剂对照组,铝盐佐剂实验组(高、中、低剂量组),MF59佐剂实验组(高、中、低剂量组),将按照分组要求配比的溶液经小鼠肌内注射3次,间隔14天,每2周尾静脉采血,末次免疫30天后取血分离血清,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清抗体水平,并和SARS-CoV-2原型株的假病毒和SARS-CoV-2 Omicron BA.1变异株的假病毒进行假病毒中和实验.结果 目的蛋白在CHO-K1工程细胞表达后可分泌到培养上清中,在相对分子质量约为70kDa处可见1条特异性蛋白表达条带,经Western blot法鉴定为Omi-S1蛋白.铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果优于无佐剂组,铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果相差不大,但MF59佐剂起效快;高、中、低剂量组的免疫诱导效果在第8周相差不大,但高剂量组起效快.假病毒中和实验表明,MF59佐剂实验组针对Omicron变异株的中和抗体水平高于铝盐佐剂组.结论 本研究所构建的Omicron S1重组蛋白免疫原性良好,在小鼠体内产生了良好的体液免疫应答,并诱导高水平的对抗SARS-CoV-2假病毒的中和抗体,对佐剂和抗原剂量初步研究,结果显示,10μg以下抗原剂量搭配MF59佐剂可获得较好的免疫效果.本研究为SARS-CoV-2变异株的重组蛋白疫苗的研制提供了实验基础.

目的:构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型，探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法:设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列，与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒，经酶切及测序鉴定后，进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液，NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液，空白组不加病毒液。转染完成后，荧光显微镜下观察荧光表达，流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性，实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达，流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示，与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均 P < 0.001）。CCK8法显示，与NC组相比，shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均 P < 0.05），24和60 h差异无统计学意义（均 P > 0.05）；shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均 P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（ F值分别为8.168、4.644、1.981，均 P > 0.05），mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（ F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663，均 P ≤ 0.01）。与NC组相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均 P < 0.01），imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均 P > 0.05）。 结论:成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型，PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强，γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。

目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:构建包载骨形态发生蛋白(BMP)-4的腺病毒并利用其骨骼肌内异位成骨特性，探索移植异位形成的自体骨进行骨缺损修补的体内效果。方法:2018年6月至2020年3月，将BMP-4基因构建入AAV载体内，纯化出AAV-BMP-4。将AAV-BMP-4吸附于明胶海绵(Gelfoam)上并植入郑州大学实验动物中心SPF饲养室饲养的SCID小鼠的股肌袋内，4周后进行AAV-BMP-4的活性测定。在小鼠背部皮下应用AAV-BMP-4，观察骨骼肌肉诱导异位成骨，待骨组织形成稳定后，取出这些骨组织移植入事先制备好的小鼠的颅骨缺损模型中，观察其骨缺损修复效果。结果:成功构建出纯化后浓度达5×10 12 vp/ml的AAV-BMP-4病毒颗粒。病毒颗粒植入小鼠的股肌袋内可成功诱导异位骨组织的形成，小鼠背部皮下植入AAV-BMP-4＋Gelfoam复合体后4周出现了少量的新生骨组织，骨量达1 cm×2 cm×2 cm。X线和MicroCT的检查均证实了小鼠的背部皮下骨组织形成。经修剪移植入小鼠颅骨缺损模型处的骨组织在植入缺损处后，没有出现异常增生的现象，而是不断地随着时间的推移进行着外形的轻微改建，颅骨缺损得到了良好的修复。 结论:体外构建的AAV-BMP-4具有良好的生物学活性，AAV-BMP-4＋Gelfoam在骨骼肌肉中可有效诱导成骨，利用新生骨组织可以成功地修复颅骨缺损的动物模型。移植的骨组织植入颅骨缺损后未出现过度生长的现象，且与宿主骨结合良好。

目的:构建携带过表达miR181a的慢病毒载体，转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)，使基因修饰后的BMSC持续高水平表达miR181a。方法:将miR181a质粒与三种助转质粒PRSV，PRRE，VSVG共同转染进293T细胞中，构建含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的过表达miR181a的慢病毒表达载体。72 h后收获过表达miR181a的病毒液，转染BMSC。用嘌呤霉素筛选，得到能够长期稳定过表达miR181a的BMSC，即miR181a-BMSC。结果:成功构建出携带miR181a的慢病毒载体，转染率超过95%。嘌呤霉素筛选BMSC，得到能够长期稳定过表达miR181a的BMSC，与BMSC组相比，miR181a-BMSC组中，miR181a的表达量明显增多，差异具有统计学意义(3.80比25.92， t＝19.401， P<0.05)。提取BMSC和miR181a-BMSC的外泌体，纯化后miR181a-BMSC的外泌体内miR181a表达量明显增高，差异具有统计学意义(1.41比0.87， t＝6.003， P<0.05)。 结论:成功构建出慢病毒介导的过表达miR181a基因修饰的骨髓间充质干细胞。

目的:研发一款一体化呼吸道合胞病毒(RSV)分型即时检验(point-of-care testing，POCT)检测试剂并评估其性能。方法:以RSV A和B亚型及ON1和BA9基因型的基因组保守序列设计特异性的引物和探针，优化PCR反应体系和条件，整合试剂玻璃化技术和多重检测平台，开发RSV分型POCT检测试剂，并对该产品的敏感度、特异度、重复性和临床性能进行评估。结果:一体化RSV分型POCT检测试剂敏感度可达500拷贝/ml，特异度好，与临床上表现相似的病原体无交叉反应，试剂批间和批内重复性Ct值的变异系数均<5%，具有较好的重复性，检测试剂应用于53例临床样本测试，检测结果与对比试剂具有较高的一致性和符合率，阳性符合率高达98.11%。结论:本研究开发的一体化RSV分型POCT检测试剂集成了"核酸提取-纯化-检测"，实现了"样本进，结果出"，操作简单，检测结果准确、可靠、稳定，可用于RSV A和B亚型的分型即时检验，为RSV的防控和诊疗提供助力。

目的:制备新型冠状病毒野生株(WT)、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1分支)等7株单克隆病毒株，用于申请国家标准株。方法:利用蚀斑纯化技术感染Vero细胞后筛选单克隆毒株，通过观察细胞病变特性与病毒形态学特征、病毒滴度与全基因组序列测定、支原体检测等方法，以评价单克隆毒株的基础生物学特征。结果:WT株、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1)7株病毒感染细胞后，细胞病变表现为细胞圆缩脱落；蚀斑纯化后的病毒支原体检测均为阴性，2代至5代的病毒滴度在10 5～10 8 TCID 50/ml之间；电镜下病毒颗粒呈圆形或者椭圆形，直径在60～140 nm之间；全基因组测序与系统进化分析明确了7种毒株的变异株类别，证实了单克隆毒株连续传代5代基因组特征稳定。 结论:制备7种代表性新型冠状病毒变异株的克隆株，具有典型冠状病毒细胞病变效应、形态结构清晰、病毒活性良好、遗传稳定等特性，可作为候选毒株用于申请国家标准株。

目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒，利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2，PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性，将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化，并对P1基因进行稳定性突变，构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量，离子交换层析纯化PV2-VLP，透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构，表明VLP成功组装。动物实验结果表明，重组制备的PV2-VLP具有免疫原性，且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗，为PV-VLP疫苗的研制提供参考。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。