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猴痘病毒微液滴数字PCR检测方法的建立
编辑人员丨1周前
目的:建立一种用于猴痘病毒(mpox virus)核酸检测的微液滴数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)检测方法。方法:设计靶向猴痘病毒 F3 L基因的特异性引物和探针,建立猴痘病毒核酸的ddPCR检测方法,对ddPCR的最适反应条件进行优化,并对ddPCR的特异性、灵敏度以及重复性进行检测。进一步对人脓拭子临床样本进行检测,对ddPCR方法检测临床样本的能力进行评价。 结果:对ddPCR反应温度和引物探针浓度进行优化,建立猴痘病毒ddPCR检测方法,该方法最低检测限可达2拷贝/μl,与其他8种病毒无交叉反应。对10份人皮肤脓液拭子临床样本中的猴痘病毒进行检测,ddPCR方法检测到5份阳性样本,实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR, qPCR)方法检测到4份阳性样本。结论:建立的猴痘病毒的ddPCR检测方法快速、特异、灵敏度高,用于临床样本中猴痘病毒检测。
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编辑人员丨1周前
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父亲 FOXF1基因体细胞-生殖腺嵌合变异导致患儿死亡1例的遗传学分析
编辑人员丨1周前
目的:探讨1例出生后2 d死亡的肺泡毛细血管发育不良伴肺静脉错位(ACD/MPV)患儿的遗传学特征及其死亡原因。方法:选取2022年9月就诊于南通大学附属妇幼保健院的1例ACD/MPV患儿作为研究对象。采集患儿的临床资料。应用全外显子组测序(WES)技术对患儿皮肤组织进行基因检测,针对候选致病变异,进行Sanger测序家系验证。应用液滴数字PCR(ddPCR)技术检测该变异在患儿父亲不同胚层来源标本中的嵌合比例。结果:患儿出生后2 d因"低氧血症和呼吸窘迫"死亡。WES结果显示患儿携带 FOXF1基因c.433C>T杂合变异,既往未见报道。Sanger测序验证患儿存在该变异,母亲该位点为野生型,父亲外周血样中该位点可见微小变异峰。ddPCR提示其父亲精液中c.433C>T变异嵌合比例为27.18%,源于3个胚层的组织中该变异嵌合比例为11%~28%。 结论:本研究患儿携带的源自其嵌合变异父亲的 FOXF1基因c.433C>T杂合变异可能为导致该患儿死亡的遗传学病因。ddPCR为检测变异嵌合的有效手段。
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编辑人员丨1周前
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数字PCR检测HIV-1完整前病毒DNA方法的建立
编辑人员丨1周前
目的:通过数字PCR建立检测HIV-1完整前病毒DNA方法。方法:通过培养8E5细胞(含有单拷贝整合HIV-1前病毒的T淋巴细胞系),提取DNA。通过连续稀释DNA,利用数字PCR扩增1倍、5倍、25倍、625倍、3 125倍和15 625倍稀释的HIV-1 Ψ区、env区和真核细胞10号染色体RPP30区,计算线性关系及最低检测浓度。在数字PCR体系中分别加入5 μl、3.1 μl、2.5 μl的DNA,各进行2批次检测,每批次重复检测4次,判断其批内变异系数,同核酸量和不同核酸量的批间变异系数判断稳定性。利用8E5 DNA检测细胞中完整前病毒含量。结果:DNA在6个稀释度下,Ψ区、env区和RPP30区线性拟合优度分别是 R2≥0.999、 R2≥0.993、 R2≥0.996。当稀释到3 125倍时,Ψ区、env区和RPP30区最低阳性液滴检出3个、2个和2个,检出浓度是2.37拷贝/μl、1.21拷贝/μl和1.58拷贝/μl。DNA的数字PCR重复性实验检测,Ψ区批内变异系数从0.66%到3.43%,同核酸量的批间变异系数分别是3.19%、4.3%和3.45%,不同核酸量的批间变异系数仅4.35%。env区批内变异系数从0.7%到3.2%,同核酸量的批间变异系数分别是3.18%、4.52%和3.4%,不同核酸量的批间变异系数仅4.02%。RPP30区批内变异系数从0.91%到2.91%,同核酸量的批间变异系数分别是3%、4.55%和3.37%,不同核酸量的批间变异系数仅在3.98%。8E5细胞中含缺陷前病毒的比例和含完整前病毒的比例分别是90%和45%。 结论:利用数字PCR能够检测HIV-1完整前病毒DNA,表现出较强的稳定性,为HIV-1感染者储存库检测提供技术手段。
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编辑人员丨1周前
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猴痘病毒微液滴数字PCR检测方法的建立
编辑人员丨2024/7/20
目的 建立一种用于猴痘病毒(mpox virus)核酸检测的微液滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法.方法 设计靶向猴痘病毒F3L基因的特异性引物和探针,建立猴痘病毒核酸的ddPCR检测方法,对ddPCR的最适反应条件进行优化,并对ddPCR的特异性、灵敏度以及重复性进行检测.进一步对人脓拭子临床样本进行检测,对ddPCR方法检测临床样本的能力进行评价.结果 对ddPCR反应温度和引物探针浓度进行优化,建立猴痘病毒ddPCR检测方法,该方法最低检测限可达2拷贝/μl,与其他8种病毒无交叉反应.对10份人皮肤脓液拭子临床样本中的猴痘病毒进行检测,ddPCR方法检测到5份阳性样本,实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法检测到4份阳性样本.结论 建立的猴痘病毒的ddPCR检测方法快速、特异、灵敏度高,用于临床样本中猴痘病毒检测.
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编辑人员丨2024/7/20
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褪黑素调控MEG3/miR-223/NLRP3轴对流感病毒感染小鼠模型肺损伤的影响
编辑人员丨2024/1/20
目的:探究褪黑素(MT)调控母体表达基因3(MEG3)/微小RNA-223(miR-223)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)轴对流感病毒感染小鼠模型肺损伤的保护情况.方法:50只小鼠按随机数字法分为对照组、模型组、MT低、中、高剂量组,每组10只.除对照组外,其余各组以5×105 EID50剂量给予H7N9病毒悬浮液滴鼻,对照组给予等体积磷酸缓冲液滴鼻.造模后当天MT低、中、高剂量组分别腹腔注射15、30、60 mg/kg MT,对照组、模型组腹腔注射等体积生理盐水.末次给药24 h处死小鼠进行实验.所有小鼠检测肺指数;苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织形态;ELISA检测肺组织中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、IFN-β水平;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小鼠肺组织中MEG3 mRNA、miR-223水平;蛋白免疫印迹检测肺组织中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)、pro-caspase-1蛋白水平.生物信息学预测和双荧光素酶实验检测MEG3与miR-223、miR-223与NLRP3的靶向关系.结果:病理结果显示模型组小鼠肺组织肺泡壁充血明显、腔内出现明显的炎症渗出及炎症细胞浸润明显;MT(低、中、高)剂量组随着MT剂量的升高,小鼠肺组织肺泡壁充血现象、腔内炎症渗出及炎症细胞浸润现象均得到改善.与对照组相比,模型组肺指数、肺组织中趋化因子、炎症因子、抗病毒因子、MEG3水平,NLRP3通路蛋白水平升高(P<0.05),miR-223水平降低(P<0.05);添加MT后抗病毒因子升高明显,其余指标均有所改善.miR-223与MEG3、NLRP3均存在靶向调控关系.结论:MT能够缓解H7N9流感病毒感染小鼠的肺损伤,可能与调控MEG3/miR-223/NLRP3轴缓解炎症有关.
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编辑人员丨2024/1/20
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口咽鳞状细胞癌中HPV DNA检测的研究进展
编辑人员丨2023/11/25
随着世界范围对烟草、酒精危害认识的增加,烟草、酒精等高危因素引起的口咽鳞状细胞癌(OPSCC)的发病率在世界范围内有所下降,但人乳头瘤病毒(HPV)相关性OPSCC的发病率在逐渐上升,其造成的疾病负担也日益加重.目前已经开发了几种用于检测OPSCC中HPV DNA的方法,每种方法在灵敏度、特异度和操作难度上有着各自的优缺点.本文总结了目前具有前景的检测OPSCC中HPV DNA的方法,并对目前的研究进展进行综述.
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编辑人员丨2023/11/25
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双重数字PCR法评价Luc2P系列报告基因细胞系的稳定性
编辑人员丨2023/8/19
目的 建立双重数字PCR(digital PCR,dPCR)法评价Luc2P系列报告基因细胞系(CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7)的萤光素酶(luciferase,Luc)基因稳定性.方法 提取Luc2P系列报告基因细胞系的基因组DNA,建立一种双重dPCR法,同时检测内参基因RPP30和目标基因Luc的拷贝数,以Luc相对拷贝数(copies Luc/copy RPP30)为指标评价Luc基因稳定性;参考《中国药典》三部(2020版)相关要求对建立的方法进行专属性、精密性、线性、准确性和耐用性验证,并分析方法的适用性.结果 未转染报告基因的原始细胞检测结果均为阴性,而4种报告基因细胞系中均可检测到阳性结果,且dPCR结果中阴性和阳性区可明显区分;以相对拷贝数为指标,采用芯片式dPCR法重复检测8次同一基因组DNA样品以及同一细胞6次独立提取的基因组DNA样品的相对标准偏差(RSD)均小于10%,Luc和RPP30的线性拟合R2均大于0.99,建立的方法检测5组加标样本的加标回收率在50%~100%之间,且芯片式dPCR和液滴式dPCR检测结果一致.该方法可区分不同细胞克隆的Luc相对拷贝数,检测3个代次(P8、P12、P31)细胞Luc相对拷贝数的结果高度一致.结论 建立的双重dPCR法专属性、精密性、线性、准确性、耐用性和适用性良好,可用于Luc2P系列报告基因细胞系的Luc基因稳定性评价.
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编辑人员丨2023/8/19
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应用液滴数字PCR技术检测rs6983267三种多态性位点
编辑人员丨2023/8/6
核苷酸的多态性检测在临床以及基础生命科学研究中占据着重要地位,目前基于PCR的探针法应用最为广泛,由于在核苷酸上微小差异,探针的设计往往带有交叉活性反应,这阻碍了qPCR方法的推广,数字PCR(dPCR)是近年来已成功实现商业化的基于单分子分析的核酸检测技术,通过对条件的优化,dPCR可以消除探针的交叉活性,不过目前商业化的dPCR一般只有2个通道,对于同时检测3个多态性需要更加细致的优化,本研究以rs6983267位点的CCAT2基因3种多态性检测为例,利用探针的交叉活性反应检测其3个多态性位点,检测涉及到3个探针:2个针对多态性位点,另1个位于多态性位点外侧作为参照探针,结果表明,成功地区分了3个包含多态性位点基因片段的簇.在本研究中交叉活性反应可以为dPCR留出白空间,利于多样品的检测.
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编辑人员丨2023/8/6
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液滴式数字PCR检测晚期非小细胞肺癌血液EGFR突变的应用价值
编辑人员丨2023/8/6
目的 采用液滴式数字PCR(ddPCR)法检测晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血循环肿瘤DNA(ctDNA)EGFR基因突变的情况,探讨试剂盒的性能、检测结果的可靠性和准确性以及ddPCR法在外周血ctDNA中的应用价值.方法 使用标准突变比例的模拟cfDNA样本ddPCR法对试剂检测限、准确性、特异性、精密度、抗干扰能力等指标进行分析及评价;使用ddPCR法检测262例NSCLC患者外周血ctDNA,随机选取30例样本同时进行Super-ARMS法检测,并从方法学标准化和检测结果准确性两方面进行统计学分析.结果 检测试剂在检测限以上的准确性、特异性均为100%,定量精密度(突变比例对数的绝对值变异系数CV)<5%,关键环节质量控制各主要参数的相关性和线性关系均符合要求;Super-ARMS和ddPCR法同步检测30例NSCLC患者外周血ctDNA的结果具有较好的一致性(Kappa=0.783,P=0.000).结论 ddPCR法灵敏度高,可绝对定量,是血液检测的有效的方法,但其在检测过程中存在较多对检测结果产生影响的环节,故而检测方法标准化至关重要.
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编辑人员丨2023/8/6
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一例TSC2基因低比例突变嵌合体基因学分析
编辑人员丨2023/8/5
目的:对一例临床表现不典型的结节性硬化症(TSC)患者进行基因突变分析以明确诊断.方法:收集一例临床上拟诊TSC的患者及其父母的外周血,通过全外显子组测序技术对先证者TSC1和TSC2基因的全部外显子及其侧翼序列进行测序,确定候选致病突变位点,同时对先证者及其父母的外周血DNA进行Sanger测序验证,并用液滴数字PCR技术确定先证者体细胞中该突变嵌合比例.结果:先证者的TSC2基因第11号外显子存在c.1096G>T(p.E366?)杂合无义突变,为微小突变峰,突变比例未高于其突变阈值,不排除嵌合体的可能.液滴数字PCR结果提示,先证者为c.1096G>T点突变嵌合体,嵌合比例为14%.结论:先证者TSC2基因发生体细胞镶嵌突变,c.1096G>T可能是该TSC患者的致病原因.液滴数字PCR有助于体细胞镶嵌突变嵌合体的确诊.
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编辑人员丨2023/8/5
