目的 为了对肉制品中牛肉源性成分进行准确定量,本文采用数字PCR(dPCR)技术对牛肉的线粒体Cytb基因进行定量检测,根据基因拷贝数建立了肉制品中牛肉源性成分PCR的定量检测方法.方法 参照标准设计的牛源性特异性引物、探针,猪源性特异性引物、探针,鸭源性特异性引物、探针以及动物源性成分通用引物、探针,建立了双重数字PCR体系.结果 在一定范围内生鲜牛肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,并以DNA含量为中间值计算出DNA拷贝数(C)与生鲜牛肉质量之间的换算公式:M 牛=0.020 9C+0.676.应用建立的dPCR方法对构建的肉样模型进行检测,结果显示牛肉定量检测值与实际质量基本一致,且受外源物种的干扰小.运用该方法对抽取的10份市售牛肉样品检测,同时通过特异/通用引物扩增的拷贝数之比(％)辅助判断肉制品中是否存在非牛源性的其他动物源性成分掺假,检测出部分样品不符合标签规定.结论 该方法可实现对牛源性成分的量化检测,能够作为区分故意添加和无意污染的依据,为执法监管部门提供有力的技术保障.

目的:初步比较6种品牌肠道病毒EV-A71/CVA16/肠道通用核酸检测试剂盒CVA6/CVA10核酸检测试剂盒的灵敏度和特异性，为检测试剂的选择及疾病监测提供参考。方法:选择EV-A71、CVA16、CVA6和CVA10四种血清型毒株作为样本盘，分别10倍梯度稀释。使用数字PCR对梯度稀释的病毒进行核酸定量后，制备混合样本盘并进行倍比稀释，使用实时荧光PCR方法检测。分析各试剂盒的检出限及灵敏度；检测非肠道病原的核酸，分析其特异度；通过分组打分和量化评分法评价扩增曲线特征及Ct值结果，进行综合评分。结果:对灵敏度的比较分析中，试剂盒E、A和F检测较为灵敏；在扩增曲线及Ct值分析中，按分值排名检测EV通用的试剂前3为A、C、E；检测EV-A71中前3名为E、A、F；检测CVA16的试剂中，前3名为A、D、E；检测CVA6的试剂前3名为E、D、F；检测CVA10的试剂中，前3名的为E、A、C。各品牌的特异性均较好。结论:在EV-A71/CVA16/EV通用3重荧光PCR检测试剂盒中，A、E、C和D综合评分较高，在CVA6/CVA10双重荧光PCR检测试剂盒中E、F综合评分较高，建议在检测肠道病毒相关的监测及疫情样本时，常备两种品牌及以上试剂盒对检测结果相互比较验证，并对扩增曲线和Ct值结果综合判断。本研究的量化评分方法可为其他荧光PCR检测试剂盒评价提供参考。

目的 建立单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的双重微滴式数字PCR检测方法.方法 基于单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的保守区域,设计特异性引物探针,通过筛选引物探针组合,优化双重微滴式数字PCR反应退火温度及引物探针浓度比,建立双重单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测反应体系,对其他病毒进行检测,对临床样本进行验证,对建立的双重微滴式数字PCR方法的灵敏性、特异性及重复性进行分析.结果 单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测方法最佳引物和探针浓度分别为800 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度是56℃;双重微滴式数字PCR检测方法的标准曲线相关系数(R2)为0.99,呈现良好的线性关系;灵敏度高,单纯疱疹病毒Ⅰ型最低检测下限为2.97拷贝/μL,水痘-带状疱疹病毒最低检测下限为2.73拷贝/μL;重复性好,变异系数小,检测结果稳定;特异性强,未发现与单纯疱疹病毒Ⅱ型、EB病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、人巨细胞病毒、肠道病毒71型、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒以及人类核酸有交叉反应.结论 本试验建立的单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR方法灵敏性强、特异性高、重复性好,可为不同场景下2种病毒的快速定量检测提供解决方案.

目的 建立双重数字PCR(digital PCR,dPCR)法评价Luc2P系列报告基因细胞系(CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7)的萤光素酶(luciferase,Luc)基因稳定性.方法 提取Luc2P系列报告基因细胞系的基因组DNA,建立一种双重dPCR法,同时检测内参基因RPP30和目标基因Luc的拷贝数,以Luc相对拷贝数(copies Luc/copy RPP30)为指标评价Luc基因稳定性;参考《中国药典》三部(2020版)相关要求对建立的方法进行专属性、精密性、线性、准确性和耐用性验证,并分析方法的适用性.结果 未转染报告基因的原始细胞检测结果均为阴性,而4种报告基因细胞系中均可检测到阳性结果,且dPCR结果中阴性和阳性区可明显区分;以相对拷贝数为指标,采用芯片式dPCR法重复检测8次同一基因组DNA样品以及同一细胞6次独立提取的基因组DNA样品的相对标准偏差(RSD)均小于10％,Luc和RPP30的线性拟合R2均大于0.99,建立的方法检测5组加标样本的加标回收率在50％～100％之间,且芯片式dPCR和液滴式dPCR检测结果一致.该方法可区分不同细胞克隆的Luc相对拷贝数,检测3个代次(P8、P12、P31)细胞Luc相对拷贝数的结果高度一致.结论 建立的双重dPCR法专属性、精密性、线性、准确性、耐用性和适用性良好,可用于Luc2P系列报告基因细胞系的Luc基因稳定性评价.

目的:本研究建立嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗产品质量控制中猿猴病毒40大T抗原(SV40LTA),腺病毒早期区域1A蛋白(E1A)和质粒残留水平的荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法,同时采用微流控芯片式数字PCR技术对质粒定量参考品进行赋值.方法:通过建立多重荧光定量PCR的方法,在一个反应中同时检测SV40 LTA和E1 A的残留水平.针对目前慢病毒等包装技术存在多种质粒组合系统(如四质粒和五质粒),对质粒的残留检测标准难以统一,本研究从同源性很高的复制子区域入手,设计和筛选引物探针,能同时检测多种不同质粒的总体残留水平.建立数字PCR技术分别对SV40 LTA和E1 A的质粒定量参考品拷贝数浓度标定方法进行方法学验证和赋值.结果:SV40 LTA和E1 A双重定量PCR方法的特异性好,最低定量限分别达到2.80×10和2.98×10 copies·μL-1.质粒残留检测法的最低定量限可达到2.80×10 copies·μL-1.通过采用目前快速发展的数字PCR技术进行赋值,经典吸光度法计算质粒定量参考品SV40LTA和E1A的拷贝数浓度为2.80×108和2.98×108 copies·μL-1;经数字PCR标定分别为1.06×108和1.21×108 copies·μL-1.结论:本研究建立的SV40LTA,E1A和质粒检测方法灵敏度较高、特异性强,能满足CAR-T细胞治疗产品的质量控制要求.经典的吸光度法定值的结果大于数字PCR方法,大约有2倍左右的差别.

目的 为实现赤小豆加工食品的真伪和品质鉴别,建立赤小豆加工食品中被误用或混用的红豆成分实时荧光聚合酶链式反应(PCR)定性和微滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)定量检测方法.方法 根据赤小豆和红豆基因组DNA中保守基因,分别设计适用于赤小豆和红豆成分实时荧光PCR定性检测的特异性引物探针,并设计适用于赤小豆加工食品中红豆成分双重ddPCR定量检测的通用引物探针,建立赤小豆加工食品中红豆成分质量百分比-DNA拷贝数浓度百分比线性关系式.结果 本方法对赤小豆和红豆基因组DNA检测低限分别为0.1和0.01 ng/μL,对赤小豆和红豆基因组DNA拷贝数浓度定量检测限均为6copies/μL,可对赤小豆加工食品中质量百分比为5％～80％的红豆成分准确定量.结论 本方法可用于赤小豆加工食品中红豆成分的定性和质量百分比定量检测.

目的:建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas13a）的乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）检测方法。方法:提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后，使用Hind Ⅲ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶（PSAD）分别进行酶切；根据松弛环状DNA（rcDNA）和cccDNA的结构差异，设计特异性扩增HBV cccDNA的引物，对酶切后的产物进行滚环扩增（RCA）和PCR扩增；并筛选crRNA，建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果:利用α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）和HBV表面抗原（HBsAg）引物对双重酶切后的产物进行扩增，验证产物中HBV基因组的存在；利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增，验证了产物中只存在HBV cccDNA；利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释，然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测，计算出检测下限为10拷贝/μl。结论:本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法，可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测，为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。

目的 利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术建立可同时检测miR-888和miR-891a的体系,并评估其在精液鉴定中的应用价值.方法 通过设计不同荧光修饰的报告基团的水解探针实现对miR-888和miR-891a的双重ddPCR检测,对5种体液(外周血、月经血、精液、唾液、阴道分泌液)共75份样本进行检测,采用Mann-Whitney U检验进行差异性分析,通过ROC曲线分析评估miR-888和miR-891a区分精液的能力并获得鉴别的最佳截断值.结果 该体系双重检测与单独检测结果差异无统计学意义,检测灵敏度可达到0.1 ng总RNA,批内与批间变异系数均小于15％.经双重ddPCR检测,精液中miR-888和miR-891a的表达量均高于其他体液.经ROC曲线分析,miR-888的AUC为0.976,最佳截断值为2.250 copies/μL,判别正确率为97.33％;miR-891a的AUC为1.000,最佳截断值为1.100 copies/μL,判别正确率为100％.结论 本研究成功建立了双重ddPCR检测miR-888和miR-891a的方法,体系的稳定性和重复性良好,可用于精液鉴定,miR-888和miR-891a均具有较高的精液鉴别能力,且miR-891a的判别正确率更高.

目的 了解云南省西南地区人类免疫缺陷病毒(HIV)/鸟结核分枝杆菌(MAV)双重感染者MAV的基因型和耐药情况.方法 选取12个可变数目串联重复序列(VNTR)特异性位点,采用分枝杆菌串联重复序列(MATR-VNTR)基因分型法对MAV进行基因分型;采用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株DNA后进行琼脂糖凝胶电泳,获得MAV的DNA指纹图谱,再应用Quantity One和BioNumerics 6.7软件对电泳图进行数字化处理并通过非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析.采用比例法测试44株MAV对10种不同抗菌药物的敏感性.结果 各位点VNTR基因分型的Hunter-Gaston指数(HGDI)存在差异,其中MATR-5最高,为0.68,MATR-1、2、3、4、6、7、9、13、15位点的HGDI值均≥0.5;通过聚类分析,44株MAV分为6个集群.药敏试验结果显示,利福布丁对MAV的体外抗菌活性最好(耐药率为0),其次是乙胺丁醇(耐药率86.4％,38/44),所有菌株对其余8种药物均耐药.结论 选取的12个位点VNTR基因分型法在云南省西南地区具有较高分辨率,来自云南省不同地区的MAV分离株耐药情况严峻.

目的 建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)和西尼罗病毒(WNV)的双重微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法.方法 基于已设计的JEV和WNV引物探针,建立JEV和WNV双重ddPCR检测反应体系,摸索检测的敏感性、特异性和可重复性,灵敏度与双重荧光定量PCR(qPCR)的每个反应管内荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数(Ct)值做对比.结果 双重ddPCR检测反应体系对JEV和WNV的检测灵敏度均可达到102拷贝/μl,该方法的可重复性、特异性良好,未发现与登革病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、蜱传脑炎病毒以及人类基因组有交叉反应.结论 建立的双重ddPCR方法能敏感、特异检测JEV和WNV,为不同场景下这2种病毒的检测提供了解决方案.