膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。免疫治疗作为一种新型的治疗方法，在尿路上皮癌领域取得了巨大成功。溶瘤病毒作为免疫治疗的一项新兴研究热点，可以通过特异性破坏肿瘤细胞或激活特异性抗肿瘤免疫的双重作用机制来达到抗肿瘤效应。目前，溶瘤病毒在膀胱癌的治疗中取得了重大突破，特别是在非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌的治疗方面。包括腺病毒、柯萨奇病毒、牛痘病毒及单纯疱疹病毒等在内的溶瘤病毒，在膀胱灌注治疗膀胱癌的多项临床试验中显示出良好的安全性和有效性。特别是在重组腺病毒干扰素α治疗膀胱癌的Ⅲ期临床试验中，高达53%的患者3个月时获得完全缓解，且无Ⅳ/Ⅴ级不良反应。本文就溶瘤病毒在膀胱癌治疗中的研究现状和进展进行综述。

目的:检测带状疱疹患者血浆可溶型CD100（sCD100）和外周血T细胞中膜型CD100（mCD100）表达变化，观察外源性CD100对带状疱疹患者CD8 + T细胞的功能调控。 方法:收集2019年7月至2021年4月在驻马店市中心医院就诊的带状疱疹患者53例以及入组年龄和性别匹配的健康对照25例。采集受试者静脉抗凝血，分离血浆和外周血单个核细胞，酶联免疫吸附试验检测血浆sCD100水平，流式细胞仪检测CD4 + T细胞和CD8 + T细胞中mCD100表达。纯化CD8 + T细胞，比较带状疱疹患者和对照CD8 + T细胞分泌毒性分子和细胞因子的差异。使用重组人CD100和重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白刺激带状疱疹患者纯化的CD8 + T细胞，观察重组人CD100对CD8 + T细胞分泌毒性分子和细胞因子的影响。组间比较采用 t检验。 结果:带状疱疹组血浆sCD100水平[（1.12 ± 0.23） ng/ml]低于对照组[（1.31 ± 0.28） ng/ml， t = 2.97， P = 0.004]，mCD100 +CD8 + T细胞比例（17.41% ± 4.26%）高于对照组（14.69% ± 3.70%， t = 2.52， P = 0.014），两组间mCD100 +CD4 + T细胞比例差异无统计学意义（2.52% ± 0.58%比2.32% ± 0.56%， t = 1.27， P = 0.208）。带状疱疹患者CD8 + T细胞中穿孔素、颗粒酶B mRNA表达以及穿孔素、颗粒酶B、γ干扰素、肿瘤坏死因子α分泌水平均低于对照组（ P < 0.05）。重组人CD100刺激后，CD8 + T细胞培养上清液中穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ、TNF-α水平[（43.68 ± 14.12）、（126.8 ± 22.92）、（12.79 ± 3.66）、（310.0 ± 79.90） pg/ml]均高于无CD100刺激组[（34.55 ± 10.78）、（99.04 ± 10.44）、（9.53 ± 2.00）、（275.6 ± 68.04） pg/ml，均 P < 0.05]。 结论:带状疱疹患者存在sCD100和mCD100表达失衡，外源性sCD100可增强带状疱疹患者CD8 + T细胞的杀伤功能。

目的 探讨溶瘤病毒感染、免疫效应细胞补充及免疫检查点阻断三者联合策略在胃癌治疗中的意义.方法 以既往实验获得的痘苗病毒为基础构建的携带T淋巴细胞趋化因子CXCL9基因和白细胞介素7(IL-7)基因的重组溶瘤痘苗病毒(VV-IL7-CXCL9)干预治疗裸鼠皮下种植瘤方式建立的胃癌荷瘤动物模型.实验建立重组溶瘤痘苗病毒瘤内注射+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)+免疫检查点阻断剂(PD-1单抗)三联干预组、三种措施单独干预组、二联干预组及空白对照组.按照既定分组给药干预后采用肿瘤生长曲线法、肿瘤抑制率法及动物活体发光法检测肿瘤治疗效果并采取ELISA法检测各组动物血清及组织匀浆CXCL9和IL-7两分子浓度.结果 动物模型治疗干预结果显示重组溶瘤痘病毒+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)+免疫检查点阻断剂(PD-1单抗)三联干预组肿瘤生长明显减缓,显著慢于其他干预组及空白对照组.结论 在胃癌动物模型干预实验中采用重组溶瘤痘病毒瘤内注射+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)+免疫检查点阻断剂(PD-1单抗)三联干预的生物免疫治疗策略具有强烈的抑瘤作用.

溶瘤病毒通过感染癌细胞,引起病毒性细胞病变并诱发宿主抗肿瘤免疫反应,从而选择性感染和杀死癌细胞.美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药物管理局(EMA)最近批准了世界上第一个用于治疗恶性黑色素瘤的溶瘤病毒制剂,命名为Imlygic.Imlygic为表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的单纯疱疹病毒I型(HSV-1)活病毒颗粒,经直接注射入肿瘤组织引起肿瘤细胞裂解和机体抗肿瘤免疫双重效应.除了HSV-1外,尚有许多不同类型的病毒已经进入临床试验,评估其生物安全性和抗肿瘤疗效.这些正在临床试验的溶瘤病毒包括腺病毒、痘病毒、麻疹病毒和呼肠孤病毒等.治疗的肿瘤包括卵巢癌、腹膜癌、肝癌、胶质瘤和黑色素瘤等.目前,溶瘤病毒治疗肿瘤的临床试验约有67项,一些临床试验已经取得了有希望的结果,从而进展到第三期临床试验.该文重点讨论目前正在临床试验中用于治疗各类癌症的溶瘤病毒,并讨论这些溶瘤病毒作为一类新的癌症治疗药物的机遇和挑战.

目的 构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,并探讨其对胃癌细胞的杀伤作用及可能的机制.方法 利用同源重组的方法在痘苗病毒VG9的TK区插入锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)基因,构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,经筛选及纯化后,测定病毒滴度.将重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD及痘苗病毒VG9分别按不同的MOI(0.01、0.1、1、10)及转染时间(12、24、36、48 h)转染至人胃癌细胞株7901,MTT法检测病毒对胃癌细胞的杀伤作用.按MOI=1将重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD及VG9分别转染人胃癌细胞株7901 48 h,同时以PBS作为对照,Western blot法检测胃癌细胞中MnSOD的表达,流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡情况.结果 经筛选及纯化后,重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD滴度为2×108 pfu/mL.MOI为1和10时,重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD对胃癌细胞的杀伤作用明显优于VG9(P＜0.05);转染24和36 h,重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD对胃癌细胞的杀伤效果明显强于VG9(P＜0.05).转染后,MnSOD蛋白可在胃癌细胞中呈高表达,且VG9-MnSOD组胃癌细胞的凋亡率明显高于VG9组及对照组(P＜0.05).结论 成功构建了重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,其对胃癌细胞具有明显的杀伤作用,该作用可能是通过促进胃癌细胞凋亡产生的.

在过去的十年间,基因疗法在肿瘤、遗传性疾病以及传染性疾病等多个领域的临床治疗中取得了突破性进展.在基因疗法中,广泛地应用了各种各样的病毒载体,按其生活史可分为整合型病毒载体(如 γ-逆转录病毒、慢病毒)和非整合型病毒载体(如腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和痘病毒).腺病毒、单纯疱疹病毒是溶瘤病毒中最常用的病毒载体,能优先感染肿瘤细胞,经复制后造成其裂解.这些病毒的特点是基因携带量大,但只能维持较短时间的外源性基因表达,加之免疫原性较强,因此需要采取肿瘤内注射的给药方式.腺相关病毒则由于其较低的免疫原性和持久的表达能力而被广泛使用于遗传缺陷性疾病的基因替代疗法中.现就用于直接在体细胞内进行稳定表达的非整合型病毒载体作一概述.

以痘苗病毒为载体的溶瘤病毒作为癌症治疗的新方向效果显著.同时,痘苗病毒还可以作为疫苗载体抵抗HIV、H5N1等病毒感染.因技术限制,重组痘苗病毒主要通过同源重组的方法获得,但此方法获得重组病毒的效率较低.随着CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9技术成功应用于多种动物、组织和细胞的基因编辑中,本研究拟利用CRISPR-Cas9技术建立高效重组痘苗载体系统.本研究首先构建了三个靶向痘苗病毒天坛株TK区的gRNA-Cas9的质粒以及重组质粒pJ2R-EGFP,通过瞬时转染gRNA-Cas9或建立gRNA-Cas9稳定细胞系后,导入重组质粒pJ2R-EGFP并感染VTT,获得表达EGFP的重组病毒.此高效重组痘苗病毒载体系统的重组效率比传统的同源重组方法大大提高.因此,本研究建立的高效痘苗病毒载体重组系统,为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供参考价值.

目的:构建携带抗成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)和抗小鼠CD3分子的双特异性抗体溶瘤痘病毒(rVVDD-BiTE.FAP),并体外检测该病毒对过表达FAP小鼠肺癌细胞株抑制作用.方法:利用同源重组技术将PF17R启动子调控的BiTE-FAP基因和PSEL启动子调控的DsRed基因克隆入缺失痘苗生长因子(vac-cinia growth factor,VGF)基因的vSC20亲本病毒TK基因处,经软琼脂空斑筛选获得VGF和TK双基因缺失的重组溶瘤痘病毒rVVDD-BiTE.FAP.采用空斑计数法比较重组溶瘤病毒和亲本病毒vSC20在小鼠肺癌细胞株中的复制能力;采用MTS法检测重组溶瘤病毒rVVDD-BiTE.FAP和rVVDD-GFP对小鼠肺癌LLC细胞株的抑制效果,并用MTS、LDH实验进一步检测溶瘤病毒和小鼠脾脏T细胞对靶细胞的协同杀伤效果,采用ELISA法检测细胞因子IL-2和IFN-γ的表达.结果:通过同源重组技术和软琼脂空斑法筛选获得rVVDD-BiTE.FAP重组溶瘤痘病毒.rV-VDD-BiTE.FAP与亲本病毒具有同等复制能力;小鼠T细胞能够增强rVVDD-BiTE.FAP抗肿瘤效果.结论:rV-VDD-BiTE.FAP具有高效抗肿瘤活性.

目的 在体外构建携带CCL5和SSTR2双基因的重组溶瘤痘病毒,并初步检测其溶瘤活性.方法 利用基因工程策略,分步构建重组痘病毒真核表达质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+;经同源重组痘病毒Western Reverse(WR)株和23轮筛选纯化后,获得纯化的重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+;经扩大培养及浓缩纯化后获得高滴度的重组溶瘤痘病毒,用ELISA和Western blot分别验证感染重组溶瘤痘病毒的HeLa细胞CCL5和SSTR2的表达变化;用CCK-8法检测了rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对两株肿瘤细胞系的杀伤活力.结果 成功构建了重组痘病毒真核表达质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+;经同源重组、筛选纯化和浓缩后,获得滴度为9.4×108 PFU/mL的重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+;ELISA和Western blot结果表明,HeLa细胞感染rVV-CCL5-SSTR2-Luc+后,其CCL5和SSTR2蛋白表达水平显著高于对照组rVV-Luc+(分别为P<0.05和P<0.01);CCK8结果表明,rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对人胚肾上皮细胞HEK293T杀伤活力极低,而rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对两株肿瘤细胞系的杀伤活力均随感染时间逐渐增强.并且rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对肿瘤细胞的杀伤活力较之对照组rVV-Luc+均显著升高(HCT116:感染48 h时P<0.05;Hela:感染48 h时P<0.05,72 h时P<0.01).结论 本研究成功构建并获得了纯化的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+,并初步验证了其杀瘤活性,为开展后续体内外实验奠定了实验基础.

目的:建立牛痘病毒粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(vaccinia virus/GM-CSF)注射液的生物学活性测定方法.方法:采用噬斑法进行感染滴度测定,结合定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)进行病毒基因组滴度/感染滴度测定;采用TF-1细胞增殖法,四参数方程拟合处理试验数据,检测不同浓度梯度的样品感染Hela细胞后表达的GM-CSF生物学活性;采用ELISA法,二次方程拟合处理试验数据,检测不同浓度梯度样品感染Hela细胞后的GM-CSF的表达量;采用ELISA法进行β半乳糖苷酶活性测定;采用肿瘤细胞(UACC 257)和正常细胞(GM 00038)进行溶瘤活性测定.结果:测定了1批牛痘病毒粒细胞巨噬细胞集落刺激因子注射液,其病毒感染滴度为6.5×108 PFU· mL-1,病毒基因组滴度/感染滴度为27,各浓度梯度孔GM-CSF表达量均大于10 pg,GM-CSF生物学活性为181 rGCU,溶瘤活性为144 rOnU,β-半乳糖苷酶活性为124 rBU.结论:对牛痘病毒GM-CSF注射液的生物学活性进行了相对全面的测定,各个项目均符合规定,能够用于该产品的质量控制,同时对同类产品的质量控制具有借鉴意义.