探讨五虎汤治疗呼吸道合胞病毒(RSV)诱发哮喘的效应物质及作用机制.使用超高效液相串联高分辨质谱仪确定五虎汤的入血成分;借助数据库对入血成分作用于哮喘的靶点进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析及基因本体论(GO)功能分析.同时将靶点蛋白及代谢物-靶点-通路等信息导入STRING数据库,构建蛋白互作网络,明确五虎汤核心成分及关键通路.体内实验部分使用RSV联合鸡卵清蛋白(OVA)建立哮喘模型,通过肺功能、苏木精-伊红(HE)染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)法、蛋白免疫印迹法及免疫组织化学法验证五虎汤对RSV诱导哮喘小鼠的干预作用.结果显示,五虎汤入血成分以黄酮类、苯丙素类、木脂素类、萜类等化合物为主,作用于儿童哮喘的核心成分有(-)-表没食子儿茶素、山柰素、异甘草素、香叶木素、桦木酸、熊果酸、瑞香素、七叶素等,钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、NOD样受体信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路等是其靶点主要作用通路.体内实验结果表明,五虎汤能够改善肺功能指标,下调白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17((IL-17)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,并且能够降低肺组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、核因子-κB亚基1(NFKB1)等蛋白的表达,减轻中性粒细胞炎症浸润及肺淤血.结果表明,五虎汤通过多组分、多靶点、多途径的协同作用干预病毒诱发哮喘,体内实验证明其能抑制NOD样受体信号通路的激活,减轻哮喘小鼠气道炎症与气道损伤.

基于肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)/磷脂酯肌醇 3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号轴研究赤芍-附子药对对慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)大鼠的治疗作用及对肝细胞再生的影响.采用牛血清白蛋白皮下及尾静脉注射联合脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)+D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)腹腔注射构建ACLF大鼠模型,实验设置正常对照(NC)组、模型(vehicle)组、赤芍-附子药对(SFYD,5.85 g·kg-1)组、促肝细胞生长颗粒(HGFG,4.05 g·kg-1)组.苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察大鼠肝组织病理变化.全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(alanineamino transferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transa-minase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL).ELISA 法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)炎症因子水平.免疫荧光染色检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞增殖相关抗原(antigen identified by monoclonal antibody,Ki67)及细胞周期蛋白(cell cycle protein B1,CyclinB 1)阳性表达.实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测HGF、结合蛋白Gab1(grb2 associated binding protein 1,Gab1)、PI3K、Akt、磷酸化 PI3K(phosphorylation PI3K,p-PI3K)、磷酸化 Akt(phosphorylation Akt,p-Akt)mRNA 及蛋白表达水平.结果显示,与vehicle组比较,SFYD组大鼠肝组织病理评分降低,肝功能及炎症反应改善,PCNA、Ki67、CyclinB 1荧光表达增强.同时与模型组相比,SFYD组HGF、Gab1蛋白表达上调,PI3K、Akt磷酸化激活.以上研究表明赤芍-附子药对通过减轻肝细胞炎症损伤以及促进肝细胞再生来达到抗肝衰竭的效应,其具体调控机制可能与激活HGF/PI3K/Akt信号通路有关.

目的 研究肠道异常代谢产物通过肝肠轴如何影响中性粒细胞胞外陷阱发生,并加剧急性肝衰竭进展.方法 对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)模型,以明确疾病状态与肝内中性粒细胞浸润及与中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)的内在关联.非靶向代谢组学系统分析肠道黏膜中代谢产物的异同,识别促发肝脏NETs的关键代谢物.在此基础上,利用抗体芯片探讨ALF进展中细胞因子与NETs的可能联系,最终聚焦并通过流式细胞及免疫荧光等方法,阐明NETs调控巨噬细胞极化及炎症因子介导的促疾病进展效应.结果 对乙酰氨基酚诱导ALF小鼠模型肝脏内有大量中性粒细胞浸润及NETs的形成.肠黏膜代谢产物的分析显示,LTD4含量显著上升,破坏了肠黏膜的屏障功能.导致内毒素和LTD4向肝脏的转移,促进NETs的形成.对肝脏细胞因子的分析表明,NETs可通过调节巨噬细胞的M1型极化,介导促炎因子的进一步释放.结论 ALF发生时,肝脏内浸润的大量中性粒细胞会被肠道中异位到肝脏的异常代谢产物刺激从而形成NETs,形成的NETs可以调节巨噬细胞的分化,进一步加剧ALF中的炎症效应.

为探讨补阳还五汤抗大鼠脑缺血再灌注损伤的机制,180只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、补阳还五汤+miR-26a-5p激动剂(激动剂)组、补阳还五汤+激动剂阴性对照(激动剂阴性对照)组,每组36只;每组又按再灌注时间分为第3、7、14天3个亚组.除假手术组外,其余各组采用线栓法诱导大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,缺血90 min后再灌注.补阳还五汤组、激动剂组、激动剂阴性对照组建模24 h后开始给予补阳还五汤灌胃,每日2次;假手术组、模型组灌胃等量生理盐水,直至处死的前1 d.激动剂组和激动剂阴性对照组建模24 h后分别于侧脑室注射miR-26a-5p激动剂和miR-26a-5p激动剂阴性对照剂,其他各组注射等量生理盐水.各组建模24 h后腹腔注射5-溴脱氧尿苷(BrdU),每日1次,直至处死的前1 d.采用改良版神经损伤严重程度评分(mNSS)评价神经功能缺损,2,3,5-三苯四氮唑(TTC)染色检测脑梗死体积,TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,免疫荧光双标记法检测BrdU/NeuN双阳性(BrdU+/NeuN+)细胞数评估新生神经元,双荧光素酶实验验证PTEN是miR-26a-5p的靶基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polyme rase chain reaction,RT-qPCR)检测 PTEN 及 miR-26a-5p 的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测 PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 的表达.结果显示,与模型组比较,补阳还五汤可促进脑缺血大鼠神经功能恢复,缩小脑梗死体积,增加BrdU+/NeuN+细胞数,上调miR-26a-5p的表达,调控PTEN/PI3K/Akt信号通路,促进神经元新生;侧脑室注射miR-26a-5p激动剂后加强上述效应.综上所述,补阳还五汤可促进脑缺血大鼠神经功能恢复,减小脑梗死体积,促进脑缺血大鼠神经元新生,其机制可能是通过miR-26a-5p激活PTEN/PI3K/Akt信号通路.

目的:分析血乳酸、纤维母细胞生长因子21(FGF21)在儿童线粒体脑肌病(ME)诊断与疗效监测中作用及意义.方法:按照1∶1∶1选取2020年8月至2023年2月昆明市儿童医院收治的47例儿童ME患儿(ME组)、47例非线粒体病 的肌肉病患儿(肌肉病组)及47例健康儿童(对照 组).给予ME患儿饮食和运动指导、左乙拉西坦、艾地苯醌、维生素C、叶酸、辅酶Q10等对症治疗,治疗后3个月评估疗效,根据疗效将ME患儿分为控制与未控制亚组.治疗前、治疗后1个月和3个月留取空腹血标本,以美国YSI 1500 SPORT型血乳酸分析仪及配套试剂盒检测血乳酸水平,以酶联免疫吸附法及酶标仪检测血清FGF21水平.比较3组治疗前血乳酸、FGF21,使用交互作用系数γ与OR值分析血乳酸、FGF21对儿童ME易感性影响的交互作用,受试者工作特征曲线(ROC)分析血乳酸、FGF21诊断儿童ME的价值,并比较ME不同疗效患儿治疗前、治疗后1个月和3个月血乳酸、FGF21、Newcastle线粒体病评分量表(NMDAS)评分变化,Pearson分析治疗后1个月和3个月 血乳酸、FGF21降低值与NM-DAS评分降低值相关性.结果:与对照组相比,ME组血乳酸、FGF21升高(t=13.901、38.082,P＜0.05);与肌肉病组相比,ME组血乳酸、FGF21升高(t=12.734、35.696,P＜0.05);对照组、肌肉病组血乳酸、FGF21相比,无明显差异(t=0.821、1.326,均P＞0.05);交互作用分析显示,血乳酸、FGF21共存所致OR值为1350.500,回归系数为7.208,交互作用OR值＜两单独因素OR值的乘积,为次相乘模型,γ=1.535＞1,血乳酸对FGF21的效应具有正向交互作用;ROC曲线显示,血乳酸+FGF21诊断儿童ME的AUC为0.904,高于血乳酸的0.839及FGF21的0.719,其诊断敏感度为78.72％,特异度为87.23％;病情获得控制患儿治疗后1个月、治疗后3个月血乳酸、FGF21、NMDAS评分低于未控制患儿(P＜0.05);相关性分析显示,血乳酸、FGF21治疗后1个月降低值、治疗后3个月降低值与NMDAS评分治疗后1个月降低值、治疗后3个月降低值呈正相关(P＜0.05).结论:ME患儿血乳酸、FGF21升高,两者具有正向交互作用,并与患儿病情、疗效密切相关.

目的:制备并表征包载CPI-444并偶联CD8抗体的纳米微粒(CNP/αCD8),探讨其对CD8+T细胞活化、增殖和抗肿瘤作用的影响.方法:采用复乳溶剂蒸发法和EDC/NHS法制备包载腺苷受体A2A(A2AR)特异性拮抗剂CPI-444(C)或香豆素6(C6)荧光素的纳米微粒并分别在其表面偶联CD8抗体,制得CNP/αCD8和C6NP/αCD8.扫描电镜和NanoPlus粒度测定仪表征纳米微粒形态和粒径,液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)法和离心法测定纳米微粒的载药量和药物释放情况,荧光显微镜和流式细胞仪检测CD8+T细胞内化C6NP/αCD8的情况,流式细胞仪、ELISA和LDH法检测CNP/αCD8对CD8+T细胞增殖、活化、细胞毒活性和杀瘤能力的影响.结果:CNP/αCD8纳米微粒为圆形、粒径约150 nm,能有效包载CPI-444和偶联CD8抗体,药物包封率和CD8抗体偶联效率分别约为60%和53.4%;CNP/αCD8纳米微粒具有良好稳定性,能被CD8+T细胞内化,抑制A2AR分子表达.生物学功能实验显示,CNP/αCD8增强CD8+T细胞的增殖能力、促进T细胞活化、分泌细胞因子及产生颗粒酶B和穿孔素,并增强CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的能力.结论:CNP/αCD8纳米微粒能显著增强CD8+T细胞免疫效应功能,其增强CD8+T细胞功能可能是通过抑制A2AR分子的表达起作用.

目的:本研究利用单细胞RNA测序分析技术(scRNA-seq)初步探索乳腺癌4T1细胞表达淋巴细胞抗原6复合物E(Ly6E)调控肿瘤免疫微环境(TIME)的潜在机制.方法:利用CRISPR-Cas9技术构建Ly6e基因敲除小鼠乳腺癌4T1细胞(Ly6E-KO),观察其和野生型细胞(Ly6E-WT)体外增殖和体内生长能力的差异.流式细胞术分选两类肿瘤组织中的CD45阳性细胞,再进行scRNA-seq分析.对于测序结果,首先利用Seurat软件包筛选差异表达基因谱,根据标记基因进行注释;再利用Cellchat和Monocle2软件分析细胞互作关系和特定免疫细胞的演化轨迹.结果:与Ly6E-WT相比,Ly6E-KO体外增殖能力无显著差异,但体内生长能力显著降低(P<0.001).ScRNA-seq分析显示,Ly6E-KO移植瘤浸润DC比例显著高于Ly6E-WT,且DC处于更加活跃的增殖和分裂状态;三种DC亚群(pDC、cDC1和cDC3)与T细胞均存在显著的互作关系.同时发现,Ly6E-KO肿瘤中浸润T淋巴细胞增殖、活化及效应相关的基因表达水平均升高,提示Ly6E-KO具有更强抗肿瘤能力.最后,本研究对人类乳腺癌队列的scRNA-seq数据进行了分析,进一步证实了上述发现.结论:肿瘤细胞Ly6e基因敲除后可通过增加TIME中DC活化及浸润,继而增强机体抗肿瘤免疫应答.

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种复杂的自身免疫疾病,传统治疗在部分重度和难治性患者中效果有限.近期研究显示,嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法在SLE治疗中展现出了具有前景的疗效.生物标志物在精准评估治疗效果和安全性方面至关重要,CAR T细胞治疗与安全性评估标志物包括传统标志物和与CAR T细胞疗法相关的标志物.传统的SLE病情监测标志物,仍可用于CAR T细胞治疗基线随访和病情监测,如血清抗双链DNA、抗单链DNA和抗核小体等自身抗体的滴度下降,血清补体水平恢复正常,以及尿蛋白/肌酐比值的改善,均提示病情得到有效控制.CAR T细胞疗效监测标志物分为B细胞和T细胞标志物.输注后,B细胞数量下降,B细胞表型以初始B细胞为主,记忆B细胞和浆母细胞的比例显著降低,表明治疗取得了疗效.输注前,初始T细胞(CD45RA+CD27+)和中央记忆型T细胞(CD45RA-CD62L+CD27+)的高比例则提示更强的抗肿瘤效应;患者的CAR T细胞表达与早期记忆分化相关的转录因子,如T细胞因子7和淋巴增强子结合因子1,提示这些患者对CAR T细胞疗法更为敏感.输注后,CD25、CD69和CD137等T细胞激活标志物,以及CD57、PD-1和Tim-3等耗竭标志物的高表达,提示T细胞的杀伤能力受到限制.CAR T细胞治疗安全性标志物不仅包括CAR T细胞分泌的效应细胞因子(如白细胞介素-2和IFN-γ),还包括单核细胞和巨噬细胞产生的细胞因子(如IL-1和IL-8),其水平可用于评估CAR T细胞疗法最常见的毒副反应[细胞因子释放综合征(cytokine release syn-drome,CRS)和免疫效应细胞相关神经毒性综合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome,ICANS)].高水平的血清巨噬细胞炎性蛋白1α对于预测CAR T细胞治疗后发生严重CRS和ICANS的风险具有较高的价值.此外,基线血小板计数和中性粒细胞绝对值可预测血液毒性,由IL-8、IFN-γ和IL-1β组成的感染相关预测模型,能够有效预测患者输注后出现严重感染的风险.CAR受体结构设计、清除淋巴细胞的化疗方式,患者曾接受的治疗选择及自身免疫状态等都会影响CAR T细胞治疗的疗效及安全性.在当前及未来将开启的相关临床研究中,应纳入全面、规范的检测和评估体系,为CAR T细胞疗法在SLE等自身免疫疾病的应用,提供比较标准.

目的 探讨环磷酰胺(CTX)及其活性代谢衍生物4-氢过氧环磷酰胺(4-HC)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的损伤效应及其机制.方法 用CTX[0(细胞对照),0.01,0.1,1,5,10,20,40和80 mmol·L-1]和4-HC[0(细胞对照),0.01,0.1,1,5,10,20,40和80 μmol·L-1)]处理SH-SY5Y细胞48 h,应用IncuCyte ZOOM系统记录细胞形态变化和生长曲线;CCK-8法检测细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞LDH释放率.CTX(0,1,5,10和20 mmol·L-1)和4-HC(0,1,5,10和20 μmol·L-1)处理SH-SY5Y细胞48 h,用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)染色法检测细胞增殖;免疫荧光法检测DNA双链断裂标志物γ-H2AX的含量和线粒体膜电位变化.CTX(0,1,5和10 mmol·L-1)和4-HC(0,1,5和10 μmol·L-1)处理SH-SY5Y细胞48 h,SeaHorse XF检测细胞糖酵解及线粒体氧化磷酸化水平.结果 与细胞对照组相比,CTX组和4-HC组的细胞融合率曲线逐渐下降;细胞活力显著下降(P<0.01),半数抑制浓度(IC50)分别为4.44 mmol·L-1和4.78 μmol·L-1;LDH释放率显著增加(P<0.01);EdU+细胞百分比显著降低(P<0.01);γ-H2AX+细胞百分比显著升高(P<0.05);线粒体膜电位显著降低(P<0.05);CTX和4-HC处理导致最大糖酵解能力、酵解储备、最大呼吸速率和ATP产生速率显著降低(P<0.05).结论 CTX和4-HC对SH-SY5Y细胞具有细胞毒性作用,可降低细胞活力,破坏细胞膜结构,抑制细胞增殖,其机制可能与导致细胞DNA损伤、能量代谢紊乱和线粒体功能障碍密切相关.

神经、内分泌和免疫系统之间借助神经递质、内分泌激素和细胞因子等联结成神经-内分泌-免疫(NEI)网络,多层次、多系统地将效果信息输出到靶器官.针刺效应可通过NEI网络级联放大,引起穴位局部微环境应答以治疗卒中后抑郁(PSD).本文分别从神经、内分泌、免疫 3 个方面系统阐释针刺治疗 PSD 的机制,并结合NEI网络从整体观揭示针刺治疗PSD的潜在机制与生物学途径,以期为针刺治疗PSD的基础研究提供可靠理论.