目的 研究黄秦艽Veratrilla baillonii根的化学成分.方法 经正、反相硅胶柱色谱、高效液相色谱制备分离,并通过波谱学数据鉴定化合物结构.结果 从黄秦艽根的95％乙醇水提取物的醋酸乙酯部位分离鉴定了24个化合物,其中10个(口山)酮苷:1-羟基-2,3,4-三甲氧基(口山)酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(1)、台湾肺形草(口山)酮苷(2)、1-羟基-2,7-二甲氧基(口山)酮-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)、1-羟基-3,4-二甲氧基(口山)酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(4)、蛇胆草(口山)酮苷B(5)、四数獐牙菜(口山)酮苷A(6)、滇黄芩苷B(7)、2,3,4,5-四甲氧基(口山)酮-1-O-龙胆二糖苷(8)、2,3,4,7-四甲氧基(口山)酮-1-O-β-D-木糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷(9)、2,3,5-三甲氧基(口山)酮-1-O-β-D-木糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷(10);8个(口山)酮:1,3-二羟基-4,7-二甲氧基(口山)酮(11)、1,7-二羟基-2,3,4-三甲氧基(口山)酮(12)、1,7-二羟基-3,4-二甲氧基(口山)酮(13)、1,7-二羟基-3-甲氧基(口山)酮(14)、1-羟基-2,3,4,5-四甲氧基(口山)酮(15)、1-羟基-2,3,4,7-四甲氧基(口山)酮(16)、1-羟基-2,3,5-三甲氧基(口山)酮(17)、1-羟基-2,3,7-三甲氧基(口山)酮(18);6个环烯醚萜苷:獐芽菜苷(19)、龙胆苦苷(20)、獐芽菜苦苷(21)、去乙酰德苦草苦苷(22)、amaronitidin(23)、当药苦酯苷(24).结论化合物1为新化合物,命名为2-甲氧基金不换苷;化合物2、3、5、6、8、10～12、14、22～24首次从该属植物中分离得到.

目的 以滇龙胆Gentiana rigescens带叶茎尖、带芽茎段、叶片、根为外植体,建立滇龙胆高效、稳定的丛芽诱导体系,筛选出适宜的植株再生途径.方法 以MS为基本培养基,在单因素实验的基础上,通过L16(45)正交及完全组合实验研究不同外植体和不同植物激素种类及其质量浓度对愈伤组织诱导、丛芽发生及植株再生的影响.结果 带芽茎段为间接器官发生最佳材料,其在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+KT 0.05 mg/L中培养10d、节上腋芽开始萌发后,基部可诱导出再分化能力极强的愈伤组织,得愈率为97.73％;15 d后愈伤组织开始分化出绿色丛芽,分化率100％;30 d后不定芽分化系数达18.65,增殖系数可达63.58.带叶茎尖为直接器官发生最佳材料,其在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT0.5mg/L中培养30d后,增殖系数亦可达44.36.2种材料培养获得的试管苗茎细瘦弱,不利于生根培养,试管苗在MS+6-BA1.5 mg几+NAA 1.5 mg/L+KT 0.05 mg/L+PP333 10 mg/L中培养60 d后可获得健壮度大为改善的复壮苗.复壮苗生根则在1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 2.0 mg/L中进行,45 d后可获得生长健壮的再生植株,生根率100％.再生苗移栽成活率达95％以上.结论 建立的滇龙胆无性快速繁殖体系,为保护滇龙胆野生资源、优质种苗繁育提供了有效途径,也为其遗传转化研究奠定了实验基础.

中药次生代谢产物积累和产地密切相关,产地鉴别以及多指标评价对保证药材质量具有重要意义.该实验采用高效液相色谱(HPLC)与傅里叶变换红外光谱(FTIR)数据融合结合偏最小二乘判别分析对滇龙胆进行产地鉴别,辅以多指标成分含量分析,以期为滇龙胆药材建立一种全面准确的鉴别和质量评价方法,为滇龙胆最佳产区筛选提供参考.采集云南、四川、广西、贵州共169份样品的FTIR和HPLC指纹图谱,并对FTIR进行多元散射校正、标准正态变量(SNV)、Savitzky-Golay(SG)卷积求导等预处理;比较FTIR,HPLC及低级、中级数据融合鉴别效果;利用HPLC分析样品中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、马钱苷酸与当药苷含量.结果发现,不同产地滇龙胆FTIR图谱存在差异,最佳预处理为SNV+ SG求导(二阶求导,窗口参数为15,多项式次数为2次).低级、中级数据融合预测集正确率为96.43％,高于FTIR,HPLC预测集正确率94.64％;低级数据融合训练集正确率为100％,优于中级数据融合99.12％.云南滇龙胆4种环烯醚萜苷含量均高于其他省份,其中药典指标性成分龙胆苦苷平均质量分数为47.40 mg·g-1,最大值达到79.83 mg·g-1,且龙胆苦苷、马钱苷酸与当药苷含量同其他省份含量差异显著(P＜0.05).云南省不同地区滇龙胆4种环烯醚萜苷总含量比较发现,大理洱源、丽江玉龙较高,分别为68.59,66.68mg·g-1,同楚雄武定、玉溪澄江、昆明寻甸(52.99,52.29,46.71 mg·g-1)差异显著(P＜0.05),可作为滇龙胆栽培和优良种质资源筛选的参考地.FTIR-HPLC数据融合定性分析结合HPLC定量分析方法为不同产地滇龙胆鉴别和质量评价提供一种全面准确的新思路,为滇龙胆资源开发与利用提供科学依据.

该研究根据川西獐牙菜转录组信息获得7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的全长cDNA序列,对该基因进行同源克隆、生物信息学分析,并构建原核表达载体、转化大肠杆菌、进行原核表达和组织特异性表达分析,以探讨川西獐牙菜裂环烯醚萜合成途径中关键酶7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的功能,为研究裂环烯醚萜类化合物合成途径奠定基础.结果表明:(1)成功克隆了川西獐牙菜SmDL7 H基因(GenBank登录号为MH243070);SmDL7H基因开放阅读框为1554 bp,编码517个氨基酸,相对分子质量为59.5 kD,等电点9.02;生物信息学预测SmDL7 H基因编码蛋白无信号肽.(2)多序列比对及进化树分析显示,SmDL7 H编码的蛋白与滇龙胆、长春花、金银花等植物的DL7 H基因编码的蛋白具有较高相似性.(3)将SmDL7 H基因连接到pET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用0.1 mol/L IPTG于25℃诱导12 h,原核表达分析发现在59.5 kD处有目的蛋白出现,表明与之前预测的蛋白大小一致.(4)荧光定量PCR分析显示,SmDL7 H基因在川西獐牙菜叶、茎、花、根、愈伤组织中均有表达,其中在叶片中表达量最高,在根中表达量最低.

目的 从滇龙胆叶片中克隆单萜合成关键酶环烯醚萜氧化酶(GrIDO)基因及其启动子序列,并进行序列分析.方法 根据滇龙胆转录组GrIDO基因序列设计基因特异性引物,使用RT-PCR方法克隆GrIDO基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,基于在线软件对GrIDO基因序列进行生物信息学分析.同时,根据GrIDO基因ORF序列,设计特异性引物,采用PCR法对该基因启动子序列进行扩增,并进行序列分析.结果 GrIDO基因(GenBank登录号KP722034)ORF全长l 557 bp,编码518个氨基酸;GrIDO蛋白相对分子质量58 920,理论等电点8.40,属于细胞色素P450超家族成员,可能定位于叶绿体;无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋(51.07％)和环(42.69％)构成;GrIDO蛋白与长春花CrIDO蛋白具有较高的相似性(85.83％),且亲缘关系较近.GrIDO基因启动子(GenBank登录号KT428570)长720 bp,具有TATA-box和CAAT-box,还具有参与脱落酸和茉莉酸甲酯应答的顺式作用元件、光应答元件和MYB结合位点.结论 GrIDO基因表达受多种因素调控.克隆了GrIDO基因ORF及其启动子,为GrIDO基因的功能验证奠定基础.

目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoAreductase,HMGR)基因的cDNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析.方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因cDNA全长.构建pEASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达.利用生物信息学方法分析克隆到的cDNA序列并预测结构和功能.采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况.结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR cDNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR cDNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2.SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白.Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系最为相近.结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上.HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量最高的是叶.结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础.

金龙胆草Conyza blinii为我国川滇黔地区的一种道地中药材,具有清热解毒、止咳平喘的功效,主要用于治疗慢性支气管炎引起的咳嗽及其他炎症.整理金龙胆草国内外文献报道,对其资源分布、化学成分、药理作用、遗传多样性、次生代谢物合成途径及应用等方面的研究进展进行综述,为该药材的资源开发利用及新药产品的研发提供参考.

植物地上-地下生物量分配反映了植物的生长策略.草本植物地上-地下生物量是否是等速生长还有争论.养分和密度会影响药用植物地上-地下生物量的分配.本研究比较了野生和栽培滇龙胆草地上-地下生物量分配的差异,分析了栽培年限和密度对栽培滇龙胆草生物量分配的影响.结果表明,野生与栽培滇龙胆草地上-地下生物量分配存在显著差异(P＜0.05),可能与土壤营养水平和竞争强度有关,但地下生物量和地上生物量为近等速生长关系.密度、密度与生长年限的交互作用均对地下生物量有显著影响(P＜0.05).滇龙胆草栽培时需控制密度并研究施肥和土壤微生物等因素对其药用部位产量(地下生物量)的影响.

目的:研究外源性茉莉酸甲酯对滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质(龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龙胆酯苷)含量及生理生化指标的影响,为茉莉酸甲酯在滇龙胆规范化种植中的应用提供科学依据.方法:分别以10、50、100、200 mg/L茉莉酸甲酯喷施滇龙胆植株2、4、6、8、10 d(喷施量均为500 mL)后,收集药材叶为样品材料,并收集相应时段未喷施处理的药材叶为对照.采用高效液相色谱(HPLC)法测定4个质量浓度下茉莉酸甲酯喷施10 d后滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量,优选茉莉酸甲酯的最佳喷施质量浓度(有效成分含量最高).采用HPLC法测定以最佳喷施质量浓度茉莉酸甲酯喷施不同时间后滇龙胆叶4种裂环烯醚萜类物质的含量,并测定其中相关生理生化指标(超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和丙二醛)水平.结果:以10、50、100、200 mg/L茉莉酸甲酯喷施滇龙胆植株10 d后,叶中4种裂环烯醚萜类物质的含量较未处理叶均不同程度增加,其中以100 mg/L茉莉酸甲酯喷施后效果最好,此时叶中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的含量分别为未处理叶的1.88、2.36和1.87倍(P<0.05).以100 mg/L茉莉酸甲酯喷施2、4、6、8、10 d后,叶中4种裂环烯醚萜类物质的含量均不同程度高于同时段未处理叶;在喷施4 d后叶中龙胆苦苷含量开始出现显著差异(P<0.05),在喷施6 d后叶中4种裂环烯醚萜类物质的含量总体较高,此时叶中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龙胆酯苷含量分别为同时段未处理叶的1.88、1.88、1.47、1.82倍(P<0.05);并自喷施4 d起,叶中各生理生化指标水平较未处理叶均显著升高(P<0.05).结论:以100 mg/L茉莉酸甲酯喷施6 d后滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量升高最明显,这可能与其提高了叶中相关生理生化指标的水平有关.

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS) 是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸 (MEP) 途径的第一个关键酶.该研究根据川西獐牙菜Swertia mussotii转录组数据, 克隆获得其DXS2基因 (Gen Bank注册号MH535905) , 命名为Sm DXS2.生物信息学分析表明Sm DXS2基因无内含子, 其开放阅读框全长2 145 bp, 编码714个氨基酸, 分别属于20种氨基酸, 其中丙氨酸、甘氨酸和色氨酸含量最高;相对分子质量为76. 91 k Da, 理论等电点为6. 50, 属亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋占36. 83％, 延伸链占9. 38％, loop占53. 78％;序列内部无信号肽, 没有跨膜区, 为非分泌型蛋白;序列中含有TPP结合位点、嘧啶结合结构域和C端的转酮酶结构域;系统发育分析结果显示Sm DXS2与滇龙胆DXS2共聚于一个分支.Sm DXS2基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为94 k Da, 与预测蛋白大小一致.该研究为进一步探讨该基因的功能和利用基因工程手段提高川西獐牙菜中环烯醚萜类化合物产量提供了理论依据.