[目的]探究MADS-box家族基因RIN的表达特征和功能,解析其对辣椒类胡萝卜素代谢的影响.[方法]基于辣椒果实发育转录组,通过RT-PCR克隆辣椒MADS-box转录因子CaRIN基因CDS全长,分析其生物信息学、表达模式、亚细胞定位、转录活性等,并探讨VIGS诱导CaRIN基因沉默对类胡萝卜素代谢的影响.[结果](1)CaRIN基因CDS全长732 bp,编码243个氨基酸,蛋白分子质量为27.95 kD,等电点(pI)为7.06,其编码蛋白具有典型的MEF2_like MADS结构域,属MICK型转录因子.(2)CaRIN基因主要在花和果实中表达,具有组织特异性;CaRIN定位在细胞核,并且具有转录激活活性.(3)CaRIN基因启动子具有ABRE等多个激素应答元件,外源脱落酸和乙烯利均能加速果实转红,诱导CaRIN及相关基因高表达.(4)VIGS诱导沉默CaRIN基因后,类胡萝卜素代谢途径基因PSY1、CCS、PDS、CRTZ、LCYB和NCED1表达水平降低为对照组的0.27～0.59倍,且果实总类胡萝卜素含量(0.379 mg/g)较对照(0.650 mg/g)显著降低.[结论]CaRIN是辣椒果实类胡萝卜素代谢过程的重要调控因子.

目的:比较正常生育男性及少弱精子症患者 DAZL基因启动子区域DNA甲基化水平的差异。 方法:采用病例对照研究，回顾性分析2018年6月至2019年6月期间于徐州医科大学附属连云港医院就诊的具有正常生育男性（对照组）15例和少弱精子症患者35例（少弱精子症组）的临床资料，对精液标本进行精子形态与精子浓度、活力分析。提取精液基因组DNA行亚硫酸氢盐处理，利用PCR体外扩增并将PCR产物经纯化后与pCR2.1载体连接及酶切验证，挑选阳性克隆进行测序和DNA甲基化程度差异比较。结果:对照组 DAZL基因启动子均呈低甲基化水平，甲基化率为0.96%±0.46%，少弱精子症组甲基化率为12.15%±11.35%，组间差异有统计学意义（ P=0.000 4）； DAZL基因甲基化率在少弱精子症组患者中个体差异明显，有12例（34.3%）患者DNA甲基化水平超过10%。 结论:DAZL基因启动子区域甲基化异常可能和少弱精子症有关，有望成为男性生精缺陷的生物学标志之一。

目的:探究乙酰转移酶KAT5对甲状腺未分化癌(ATC)细胞放射敏感性的影响及机制。方法:检测人ATC细胞及正常人甲状腺细胞中内源性KAT5表达水平，使用克隆形成实验探讨KAT5特异性抑制剂NU9056对人ATC细胞及正常甲状腺细胞放射敏感性影响。借助蛋白质印迹、miRNA测序、qRT-PCR、双荧光素酶报告基因等手段，并检索JASPAR、TCGA等数据库，探讨KAT5调控ATC放射敏感性的机制。结果:人ATC细胞中内源性KAT5蛋白及基因水平均显著高于正常人甲状腺细胞，而NU9056能显著提高人ATC细胞8505C和CAL-62的放射敏感性，但对正常人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1却无增敏作用。下调KAT5和NU9056均可降低ATC细胞中miR-210水平，而NU9056可降低细胞中转录因子c-Myc表达。miR-210启动子核心区域存在转录因子c-Myc的结合位点，而c-Myc可提高miR-210启动子荧光素酶活性。miR-210高表达是甲状腺癌患者的不良预后因素。上调miR-210能降低ATC细胞中TET2基因表达，而下调miR-210则起相反作用。结论:过度激活的KAT5/miR-210/TET2通路可能造成ATC的放射抵抗，成为临床ATC放射增敏的潜在靶点。

目的:研究人肝癌组织中S期激酶相关蛋白2（SKP2）表达与预后的关系以及肝癌细胞中SKP2表达对人肝癌细胞放射敏感性的影响。方法:使用TCGA数据库中肝癌组织和正常对照组织的测序结果，分析 SKP2基因在肝癌组织中的表达情况及其与患者预后的关系。使用Western blot检测肝癌细胞放射照射前后SKP2蛋白水平表达变化。利用CRISPR/Cas9技术敲除肝癌细胞 SKP2基因的启动子和第1外显子，建立 SKP2基因敲除的PLC/PRF/5和Hep3B肝癌细胞系模型，并进一步进行放射照射。用克隆形成实验检测 SKP2基因敲除细胞的放射敏感性变化情况。 结果:对TCGA数据库分析结果显示，与正常组织比较， SKP2基因在肝癌组织中表达升高。对 SKP2高、低水平肝癌患者总体生存率进行K-M法分析，结果显示 SKP2高表达肝癌患者预后相对较差，其5年生存率为34.6%， SKP2低表达肝癌患者则为50.6%（ HR=2.18，95% CI为1.46~3.27， P<0.001）。体外细胞实验显示肝癌细胞受到放射照射后SKP2表达水平明显升高。在CRISPR/Cas9敲除SKP2 -/-肝癌细胞中，克隆形成实验结果显示SKP2 -/-肝癌细胞的放射敏感性较SKP2 +/+明显增加。 结论:SKP2基因在肝癌组织中表达升高，且高表达者较低表达者预后差。放射可上调PLC肝癌细胞SKP2的表达水平，而敲除 SKP2后其放射敏感性明显增加。

目的:对1个遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系进行实验室表型和基因变异分析，初步探讨其分子发病机制。方法:选取2021年7月17日因"慢性胃炎"就诊于宁波市第二医院的1例遗传性FⅫ缺陷症男性先证者及其家系成员(共3代7人)作为研究对象。检测先证者及其家系成员凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ：C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ：C)、凝血因子Ⅺ活性(FⅪ：C)、FⅫ活性(FⅫ：C)和FⅫ抗原(FⅫ：Ag)等指标以明确诊断。采用DNA直接测序分析 F12基因的所有外显子、侧翼、5′和3′非翻译区及家系成员相应的变异位点区域，用克隆测序进一步证实所发生的变异。用生物信息学软件分析变异对蛋白功能的影响。 结果:先证者为47岁男性，APTT为180.0 s，明显延长，FⅫ：C和FⅫ：Ag均<1.0%，极度降低。先证者父亲、母亲、弟弟、大儿子及小儿子FⅫ：C和FⅫ：Ag均有不同程度降低。基因分析显示先证者 F12基因第10外显子存在c.1092_1093insC(p.Lys365Glnfs*69)杂合插入变异及第14外显子存在c.1792_1796delGTCTA(p.Val579Hisfs*32)杂合缺失变异，c.1092_1093insC为已报道的致病性变异。其母亲和大儿子携带c.1092_1093insC杂合插入变异，父亲、弟弟和小儿子携带c.1792_1796delGTCTA杂合缺失变异。第1外显子启动子区46C/T多态性分析显示先证者、大儿子和小儿子为46T/T型，其余人均为46C/T型。生物信息学软件分析第579位氨基酸残基为高度保守的位点，变异后增加了一个苯环及周围氨基酸的氢键发生了改变。根据美国医学遗传学与基因组学学会相关遗传变异分类标准和指南，c.1792_1796delGTCTA变异评级为致病性变异(PVS1＋PM2_Supporting＋PM4)。 结论:F12基因母源的c.1092_1093insC(p.Lys365Glnfs*69)杂合插入变异及父源的c.1792_1796delGTCTA(p.Val579Hisfs*32)杂合缺失变异可能是该家系FⅫ水平降低的原因。上述发现丰富了FⅫ缺乏症的基因-表型谱。

目的:探讨不同的错配修复（MMR）蛋白和微卫星不稳定性（MSI）状态检测方法在子宫内膜癌分子分型中的一致性及差异原因。方法:收集2021年1月至2023年4月北京大学第三医院病理科诊断的214例子宫内膜癌患者，对其MMR蛋白的免疫组化（MMR-IHC）检测结果进行复核，通过二代测序（NGS）技术进行MSI状态（MSI-NGS）及多基因体细胞突变、胚系MMR基因突变检测，计算肿瘤突变负荷（TMB）值。对MMR-IHC检测与MSI-NGS检测结果不相符的患者进一步进行MSI-PCR检测和MLH1基因启动子甲基化检测，并结合TMB值综合评估MMR、MSI状态，明确分子分型。结果:（1）214例子宫内膜癌患者中，POLE突变（POLEmut）型22例，错配修复缺陷（MMR-d）型55例，p53异常（p53abn）型29例，无特殊分子改变（NSMP）型108例。其中，MMR-d型患者的中位确诊年龄为54岁、侵袭性病理亚型（包括子宫内膜样癌G 3和非子宫内膜样癌）的比例为40.0%（22/55），均高于NSMP型［分别为50岁、12.0%（13/108）］，两者分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.05）。（2）214例患者中，MMR-IHC检测显示，153例患者判定为错配修复正常（MMR-p），49例判定为MMR-d，12例患者难以直接判读；MSI-NGS检测显示，164例患者判定为微卫星稳定性（MSS；与MMR-p对应），48例患者判定为高度微卫星不稳定性（MSI-H；与MMR-d对应），2例患者因有效测序深度未满足质控标准而无MSI结果。MMR-IHC检测与MSI-NGS检测结果的一致率为94.3%（200/212），12例不符合患者的MMR-IHC检测结果为MMR-d或亚克隆缺失，但MSI-NGS检测均判定为MSS，其中MLH1和PMS2蛋白表达共缺失或亚克隆缺失10例。12例不符合患者中，3例检出POLE基因致病性突变而归为POLE突变型；另外9例患者中，8例有MSI-PCR检测结果的患者中5例为MSI-H、3例为低度微卫星不稳定性（MSI-L），7例TMB值高于10个突变/Mb，6例检出MLH1基因启动子甲基化，综合分析后9例患者均判定为MMR-d。（3）55例MMR-d型子宫内膜癌患者中，15例（27.3%，15/55）确诊为Lynch综合征。15例Lynch综合征相关MMR-d型子宫内膜癌患者的TMB值［（71.5±20.1）个突变/Mb］显著高于40例散发性MMR-d型子宫内膜癌患者［（41.9±24.3）个突变/Mb； t=3.51， P=0.001］；20例MSH2和（或）MSH6蛋白表达缺失患者的TMB值［（71.0±26.2）个突变/Mb］显著高于35例MLH1和（或）PMS2蛋白表达缺失者［（38.2±19.1）个突变/Mb； t=-4.71， P<0.001］。55例MMR-d型子宫内膜癌患者中，突变率排序前10个的基因是PTEN（85.5%，47/55）、ARID1A（80.0%，44/55）、PIK3CA（69.1%，38/55）、KMT2B（60.0%，33/55）、CTCF（45.5%，25/55）、RNF43（40.0%，22/55）、KRAS（36.4%，20/55）、CREBBP（34.5%，19/55）、LRP1B（32.7%，18/55）、BRCA2（32.7%，18/55）基因，其中PTEN、ARID1A、PIK3CA基因共突变率为50.9%（28/55）。 结论:MMR-IHC检测与MSI-NGS检测结果的—致率较高，两种方法检测结果不一致多见于MLH1基因启动子高甲基化状态导致的MLH1和PMS2蛋白表达共缺失或MMR蛋白亚克隆缺失，必要时应结合MLH1基因甲基化、MSI-PCR、MMR基因胚系突变及TMB值综合评估MMR、MSI状态，为子宫内膜癌患者提供精准的分子分型。

目的:研究缺氧诱导的泛素羧基末端水解酶L5 (UCHL5）在调节宫颈癌Hela细胞辐射敏感性中的作用。方法:以宫颈癌Hela细胞为研究对象，1% O 2条件下培养观察UCHL5表达水平的变化。采用Western blot和实时定量聚合酶链反应（PCR）检测慢病毒载体感染Hela细胞后稳定调变UCHL5的效率，转录本分为空白对照组、过表达对照组、过表达UCHL5组转录本1~4和沉默对照组、沉默UCHL5组转录本1~2。将实验所用的细胞分为过表达对照组、过表达UCHL5组、沉默对照组和沉默UCHL5组。采用流式细胞术检测8 Gy γ射线照射48 h后细胞的凋亡率；采用细胞克隆形成实验检测0、2、4、6 Gy γ射线单次照射培养2周后4组细胞的克隆形成率；采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验检测4组细胞培养1周后的增殖率以及联合0、2、4、6、8、10 Gy γ射线照射后的增殖率。使用基因表达谱数据动态分析癌症基因组图谱数据库宫颈癌组织和正常组织中抗缺氧诱导因子1α（HIF-1α）与UCHL5表达的相关性。采用双荧光素酶报告基因实验观察HIF-1α对UCHL5的激活作用。组间比较采用单样本 t检验，采用Pearson检验进行相关性分析。 结果:缺氧可诱导宫颈癌Hela细胞UCHL5的表达。Western blot和实时定量PCR结果显示，感染后的Hela细胞可显著上调或下调UCHL5的表达，其中，过表达UCHL5组转录本2和沉默UCHL5组转录本2的表达均较高，所以选择此2种转录本进行后续实验。克隆形成实验结果显示，与接受相同剂量照射的过表达对照组相比，上调UCHL5增加了Hela细胞的克隆形成率，在0、2、4、6 Gy剂量照射后克隆形成率的差异均有统计学意义（ t=14.16、19.22、8.76、6.79，均 P<0.05）。流式细胞术结果显示，与沉默对照组相比，沉默UCHL5促进了Hela细胞的凋亡（ t=10.29， P<0.05），增加了γ射线诱导的细胞凋亡率( t=52.01, P<0.05)。MTT实验结果显示，与过表达对照组相比，上调UCHL5可升高宫颈癌Hela细胞的增殖率，增殖率在第3天时差异有统计学意义( t=3.905， P<0.05)；与过表达对照组相比，等剂量照射UCHL5上调组升高了受照细胞的增殖率，在剂量为6、8、10 Gy时，细胞的增殖率差异均有统计学意义（ t=3.40、4.06、3.68，均 P<0.05）。宫颈癌组织中HIF-1α表达水平和UCHL5表达水平呈正相关（ R=0.31， P<0.01），双荧光素酶报告基因结果显示HIF-1α结合并激活UCHL5启动子的活性，其活性增加了2.5倍（ t=30.47， P<0.05）。 结论:缺氧条件下，宫颈癌Hela细胞中UHCL5的诱导表达降低了细胞的辐射敏感性，其潜在的机制可能与HIF-1α转录激活UCHL5的表达有关。

目的:分析HBV为C基因型的HBsAg阳性母亲核心启动子（BCP）区突变与宫内传播的关系。方法:2011年6月至2013年7月太原市第三人民医院妇产科HBsAg阳性母亲及新生儿399对。收集一般人口学资料，采用荧光定量PCR和电化学发光法分别检测母婴血清HBV DNA及HBV血清学标志物。选择HBV DNA载量≥10 6 IU/ml的113例母亲为研究对象，其新生儿发生宫内传播的22例为宫内传播组，随机选取其中22例未发生宫内传播者作为对照组，母亲HBV DNA经提取、扩增、克隆、测序和序列编辑及剪接后与从NCBI下载的标准序列比对进行基因分型，最终选择C基因型的39例母亲进行突变分析。 结果:HBV为C基因型（88.63 %）的母亲共39例，其中宫内传播组19例，对照组20例。母亲A1762T/G1764A双突变率在两组差异显著（7.53 % vs. 27.72 %， P<0.001）。非条件logistic回归分析显示A1762T/G1764A双突变可能是宫内传播的保护因素（a OR＝0.065，95 %CI：0.006～0.746， P＝0.028）。母亲A1762T/G1764A双突变可能与新生儿HBeAg水平有关（ P＝0.050）。 结论:HBV C基因型的HBsAg阳性母亲HBV DNA BCP区A1762T/G1764A双突变可能降低HBV宫内传播的风险。

目的:探讨HBsAg阳性母亲C基因型HBV DNA CpG岛的类型、长度、CG位点等的分布特点及其与HBV宫内传播的关系，为HBV宫内传播机制研究提供新视角。方法:连续收集2011年6月至2013年7月太原市第三人民医院妇产科住院分娩的HBsAg阳性母亲及其新生儿，通过面对面问卷调查及电子病历收集流行病学资料，采用电化学发光法和荧光定量PCR分别检测母亲及新生儿HBV血清学标志物及血清HBV DNA。以新生儿出生24 h内乙型肝炎（乙肝）疫苗/乙肝免疫球蛋白注射前股静脉血HBsAg和/或HBV DNA阳性判定为HBV宫内传播。将HBV宫内传播者中HBV DNA载量≥10 6 IU/ml（满足克隆测序要求）的22例母亲及其新生儿作为宫内传播组，从未发生宫内传播者中随机选取HBV DNA载量≥10 6 IU/ml的22例作为对照组，以HBV DNA测序分型结果为C基因型的39例母亲进行HBV DNA CpG岛分布预测等分析。 结果:39例HBV C基因型的母亲中，宫内传播组19例，对照组20例。39例C基因型者HBV DNA均含有传统CpG岛Ⅱ、岛Ⅲ，而对照组中有传统CpG岛Ⅰ以及新型CpG岛Ⅳ、岛Ⅴ；HBV宫内传播组和对照组母亲携带的HBV DNA CpG岛Ⅱ、岛Ⅲ长度和CpG岛Ⅱ CG位点个数分布不同，差异有统计学意义（ P<0.05），HBV宫内传播组中CpG岛Ⅱ长度≥518 bp且其CG位点个数≥40个（11/19）的比例明显高于对照组（2/20），差异有统计学意义（ P<0.05）；位于X基因启动子区的CpG岛Ⅱ长度和CG位点个数大于对照组，差异有统计学意义（ P<0.05）。HBV宫内传播组中大部分母亲（12/19）携带的HBV DNA CpG岛Ⅱ完全覆盖了Xp区，明显多于对照组（5/20），且其HBV DNA Xp区CG位点个数大于对照组，差异有统计学意义（ P<0.05）。 结论:HBsAg阳性母亲C基因型HBV DNA CpG岛分布与宫内传播有关，CpG岛Ⅱ长度长、CG位点个数多可能会增加HBV宫内传播的发生风险。

目的:对丝氨酸水解酶家族1（FSH1）蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法:以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，PCR扩增FSH1基因及EGFP基因；同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA，将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体；将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法，用重组质粒转化犬小孢子菌，使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子（Ptrpc）和终止子（Ttrpc）调控下在犬小孢子菌中整合型表达，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果:成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体；融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论:FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中，为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础。