目的:探讨宏基因组高通量测序（mNGS）所揭示的感染谱特征，为异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后感染诊断提供参考。方法:选取2018年1月至11月河北燕达陆道培医院行allo-HSCT后出现全身或局部感染症状的血液病患者64例。用mNGS方法检测血液、脑脊液、肺泡灌洗液等标本中存在的所有病原微生物基因序列，并结合患者的临床表现确定致病或疑似致病的病原体。结果:共对64例allo-HSCT患者进行了97份样本的mNGS检测。革兰阳性菌中最常见为溶血葡萄球菌（19例次）和人葡萄球菌（14例次），革兰阴性菌中最常见为鲍曼不动杆菌（8例次）；病毒中最常见的为巨细胞病毒、EB病毒和细环病毒（分别为35、22和23例次）；真菌中最常见的为球形马拉色菌（14例次）和近平滑念珠菌（8例次）。3例检测到结核分枝杆菌复合群，均见于急性髓系白血病移植后患者。1例患者痰液中检测到口腔支原体，寄生虫未见。结论:mNGS可全面揭示血液病allo-HSCT后的感染谱，尤其对于少见和难培养病原微生物检测具有显著优势，可有效帮助临床感染病原体的诊断。

目的:建立含有内部阳性对照的支原体荧光PCR检测方法并进行验证，以期用于支原体的快速检测。方法:建立含有内部阳性对照的支原体荧光PCR检测方法并进行专属性、检测限和耐用性评价。应用建立的方法检测发热伴血小板减少综合征毒种是否污染支原体，并与培养法和指示细胞法结果相比较。结果:建立的支原体荧光PCR检测方法特异度好，可以扩增11种含有支原体16S rRNA基因的质粒，扩增效率较高。与生孢梭菌、丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳杆菌、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉、白念珠菌、Vero细胞、RD细胞、SF9细胞基因组DNA均无交叉反应。内部阳性对照扩增效率与支原体目的基因扩增效率基本一致，可用于检测是否存在PCR抑制物。检测敏感度高，用7500 Fast实时荧光定量PCR系统可检测到10菌落形成单位(CFU)/ml的发酵支原体，5 CFU/ml的精氨酸支原体、鸡毒支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾原体、口腔支原体、肺炎支原体、滑液支原体，以及1 CFU/ml的螺原体。耐用性好，在每种支原体检测限水平上，不同型号荧光定量PCR仪阳性检出率差异无统计学意义。应用该方法检测发热伴血小板减少综合征毒种为支原体阳性，与培养法和指示细胞法结果一致。结论:本研究建立的含有内部阳性对照的支原体荧光PCR检测方法特异度好、敏感度高、耐用性好，可作为支原体检测的替代方法用于支原体的快速检测。

[目的]鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节.通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法.[方法]基于MG的mgc2 基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针,优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法,评价其灵敏度、特异性、稳定性,同时对 120 份临床样品进行检测.[结果]双重LFD-RPA检测方法在 37℃下反应 5-10 min即可完成扩增,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1 最佳引物配比为 0.6∶1.4.MG、MS的最低检出限分别为 3.75 copies/μL、3.46 copies/μL.用该方法与OIE推荐的PCR方法对 120 份样品进行检测,二者符合率为 93.3%.[结论]MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增,其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好,无需使用任何仪器即可观察到结果,适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测.

[背景]新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的传染可能会引发作为二类传染病之一的新城疫(Newcastle disease,ND),给养禽业带来巨大的经济损失,因而早期、精准的 NDV 筛查是防治 ND 暴发的关键.[目的]针对新城疫病毒(NDV)建立结合 TaqMan 探针的反转录环介导等温扩增技术(RT-TaqMan-LAMP)快速检测方法.[方法]根据NDV F基因序列设计特异性引物组和TaqMan探针,以重组质粒pMD-NDV-F为阳性标准品优化反应条件,验证该方法的特异性、灵敏性和重复性,同时与国家标准(GB/T 16550-2020)中推荐的RT-qPCR方法比较,对 70 份实际样本进行验证.[结果]最佳反应条件为 61℃60 min.引物和探针最优浓度:1.6 μmol/L(FIP/BIP)、0.2 μmol/L(F3/B3)、0.8 μmol/L(LF/LB)、0.2 μmol/L(GTP).最低检测限为 1.651×102 copies/μL,灵敏性是LAMP方法的100倍.无非特异性扩增,与禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)、鸡传染性囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)及疱疹病毒(herpes virus,HSV)均无交叉反应,批次内和批次间变异系数(coefficient of variation,CV)均小于 3%.在 70 份临床样品的检测中本方法比RT-qPCR方法多检测出 1 份阳性样本,经 2 次复测二者的符合率为 98.57%.[结论]本研究建立的NDV RT-TaqMan-LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,并能有效避免非特异性扩增,可用于NDV的精准检测和流行病预防.

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是一种基因组较小的微小生物,它是最小的可自由生活、无细胞壁、可自我复制的原核生物.MP是引起社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)的常见病原体,可侵犯呼吸道引起喉炎、咽炎、支气管炎、非典型肺炎和加重哮喘,亦可引起肺外并发症.MP通过黏附细胞器黏附于宿主呼吸道上皮细胞从而破坏气道黏膜的完整性和免疫防御功能,P 1蛋白作为一个关键黏附蛋白,不仅在MP与宿主细胞黏附过程中发挥重要作用,还参与MP在气道表面的滑行和在气道的定殖和致病性.本文对P 1蛋白的结构、功能及其致病性等方面进行综述,重点关注P 1蛋白参与MP黏附、滑行和致病的作用机制.

[背景]禽滑液囊支原体是感染鸡的一种重要病原体,给我国的家禽养殖业带来了严重的经济损失.[目的]评价从病鸡中分离到的3株禽滑液囊支原体的致病性,以期丰富不同区域来源的分离株对鸡致病性的认识.[方法]分别用分离株CHN-WF224-2016、CHN-BZJ2-2015、CHN-JNB19-2016感染商品肉鸡,并在攻毒后第10天和21天进行实验室解剖,通过气囊和足垫的临床病变、血清学检测结果及气管粘膜病理形态学改变来比较评价分离株的致病力.[结果]CHN-BZJ2-2015和CHN-WF224-2016分离株能引起明显足垫肿胀和关节滑膜炎,其中CHN-BZJ2-2015分离株致病力最强,感染21 d后的血清学检测和气管粘膜厚度与CHN-JNB19-2016分离株和MS-H疫苗株比较差异显著(P<0.05).[结论]本研究表明我国目前流行的禽滑液囊支原体菌株其致病力存在明显差异,强调养殖场要积极控制和预防禽滑液囊支原体感染的重要性,同时为今后该疫苗的研发积累了实验数据.

[背景]滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染能够引起鸡和火鸡的气囊炎、关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎等.有研究表明,许多支原体中与代谢相关的酶类不仅分布在细胞质,也分布于细胞膜表面,通过结合宿主细胞的胞外基质蛋白,协助病原菌黏附入侵宿主细胞.已有报道牛支原体(Mycoplasma bovis)和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase,FBA)分布在膜蛋白和胞浆蛋白中,而MS的FBA蛋白还未见相关研究.[目的]对MSFBA蛋白进行生物信息学分析、原核表达、免疫原性分析及亚细胞定位检测,为进一步探索MS代谢相关酶类的生物学功能奠定基础.[方法]通过分析软件PSORTb、SignalP 4.1 Server和TMHMM Server在线预测MSFBA的亚细胞定位、信号肽及跨膜区,并用BLASTn和MEGA 5.0进行同源比对及进化树分析;通过Overlap PCR点突变扩增MS的fba全基因序列,连接表达载体pET-28a(+)并进行原核表达及纯化,获得纯化后的重组MSFBA (rMSFBA)蛋白;用MS阳性血清进行Western blot鉴定rMSFBA的免疫原性;用纯化的rMSFBA蛋白制备兔多克隆抗体,与MS全菌蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白进行Western blot分析,同时对MS全菌进行悬浮免疫荧光分析,检测MSFBA的膜定位情况.[结果]生物信息分析预测MSFBA分布在细胞质中,无信号肽,无跨膜区,在MS种内相似性高达99％,与其他种属FBA相似性在61％?78％之间,进化树显示其与牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、仓鼠支原体(Mycoplasma cricetuli)等的FBA蛋白进化关系较近,与精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominis)等的FBA蛋白进化关系较远;表达rMSFBA蛋白并纯化,经测定其相对分子质量大小约为33 kD;rMSFBA能与MS阳性鸡血清特异性结合,证实其具有较好的免疫原性;Western blot显示抗rMSFBA的兔血清能与MS全菌蛋白和胞浆蛋白反应,而与膜蛋白不反应,说明MSFBA蛋白分布于胞浆中;悬浮免疫荧光实验证实MS的细胞膜上未见FBA蛋白分布.[结论]首次报道了滑液支原体的FBA蛋白是一个高度保守的免疫原性蛋白,主要分布在细胞质中,该结果为进一步研究MSFBA蛋白的生物学功能提供了分子基础.

目前,肺炎支原体肺炎发病机制尚不明确,临床治疗以缓解临床症状、改善肺功能等为主. 阿奇霉素可抑制细菌转肽过程,迅速控制感染,以改善临床症状、体征. 布地奈德混悬液为糖皮质激素,具有舒张平滑肌、局部抗炎等作用,且可纠正细胞因子平衡紊乱, 改善肺功能. 本研究选取我院 198例肺炎支原体肺炎患儿, 分组研究布地奈德混悬液雾化吸入、阿奇霉素联合治疗效果. 报告如下.

[目的]研究滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)脂蛋白P80的免疫反应性及其在MS血清抗体ELISA检测中的应用.[方法]对MS P80的氨基酸序列进行生物信息学分析、原核表达和纯化,并用免疫印迹法分析其与6种不同MS分离株阳性血清的免疫反应性以及与其他禽病原血清的交叉反应性;运用纯化的MS P80表达蛋白作为包被抗原建立了MS血清抗体的间接ELISA检测方法,对其敏感性和重复性进行检测;比较检测了与美国爱德士检测试剂盒对50份临床血清样品的阳性符合率.[结果]生物信息学分析预测MS P80蛋白为脂蛋白且含有信号肽,其在MS种内同源性高达98％-100％,与其他种属P80蛋白同源性在25％-34％之间,成功表达和纯化了MS P80重组蛋白(rMS P80);Western blotting分析表明纯化的rMS P80具有良好的免疫反应性和特异性;运用rMS P80建立的MS血清ELISA抗体检测方法可对不同株MS阳性血清进行抗体效价检测,而对其他禽病原阳性血清均无交叉反应性;该检测方法的批内变异系数小于5％,批间变异系数小于10％,重复性良好;与美国IDEXX检测试剂盒比较,本文建立的ELISA抗体检测方法敏感性更高,阳性符合率为75％,阴性符合率为89.47％,总样本符合率为86％.[结论]MS P80具有较好的免疫反应性、种内保守性和种间特异,并且可用作MS抗体检测的靶标抗原.

[背景]许多研究表明,支原体的NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)不仅在胞浆中发挥生物酶学功能,也存在于细胞膜上发挥黏附宿主细胞功能.[目的]对滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的NOX进行酶学活性及亚细胞定位研究,分析其在MS致病过程中的潜在作用.[方法]对MS的NOX蛋白进行原核表达、纯化,然后对重组MSNOX (rMSNOX)的酶学活性及影响酶活的条件进行研究,测定其酶比活力、米氏常数及最大反应速率,接着用MS阳性血清及制备的rMSNOX兔多克隆抗体,分别与rMSNOX蛋白及MS全菌、膜蛋白和胞浆蛋白进行Western blotting 反应,鉴定rMSNOX的免疫原性及其在MS中的分布情况.[结果]在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达rMSNOX蛋白,相对分子质量约为53kD,并获得纯化的rMSNOX蛋白;酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率Vmax为21.8 μmol/(L·min),米氏常数Km(NADH)为244.0 μmol/L;rMSNOX蛋白与MS阳性血清特异性结合,证明具有良好的免疫原性;亚细胞定位研究表明NOX蛋白主要存在于MS的胞浆中,细胞膜上有少量的分布.[结论]首次证实MS的NOX不仅具有NADH氧化酶活性,也是MS具有免疫原性的膜蛋白,为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础.