目的:探索长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LINC01133对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSC）成牙骨质分化潜能的影响及其作用机制。方法:收集2021年9月至2022年1月第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科17~30岁10例就诊患者因正畸需要或因阻生拔除的牙齿共12颗，从离体牙上提取hPDLSC，分别转染靶向LINC01133小干扰RNA（small interfering RNA-LINC01133，si-LINC01133）或阴性对照小干扰RNA（small interfering RNA-negative control，si-NC），以转染si-LINC01133为实验组，转染si-NC为阴性对照组。利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测si-LINC01133的沉默效率；通过蛋白质印迹法检测hPDLSC成牙骨质分化相关蛋白包括骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙骨质附着蛋白（cementum attachment protein，CAP）、牙骨质蛋白1（cementum protein-1，CEMP-1）的表达；利用流式细胞术和线粒体超氧化物指示剂MitoSOX检测细胞线粒体活性氧产量；通过JC-1荧光染色法检测线粒体膜电位水平；利用蛋白质印迹法检测线粒体呼吸链复合体蛋白包括NADH脱氢酶［泛醌］1β亚单位8（NADH dehydrogenase［ubiquinone］1 beta subcomplex subunit 8，NDUFB8）、琥珀酸脱氢酶亚单位A（succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A，SDHA）、泛醌-细胞色素c还原酶核心蛋白1（ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1，UQCR1）、细胞色素c氧化酶亚单位4亚型1（cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1，COXⅣ）、ATP合成酶F1亚单位α（ATP synthase F1 subunit alpha，ATP5A）的表达水平。结果:hPDLSC的LINC01133表达水平被si-LINC01133有效沉默（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.385±0.128）（ t=10.72， P<0.01），沉默效率超过60%。LINC01133沉默后，hPDLSC BSP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.664±0.179）（ t=4.62， P<0.01）；CAP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.736±0.229）（ t=2.83， P<0.05）。LINC01133沉默后，hPDLSC线粒体活性氧产量显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.458±0.185） （t=4.96， P<0.05）；线粒体膜电位水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.209±0.029）（ t=53.99， P<0.01）；NDUFB8表达水平显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.683±0.397）（ t=3.45， P<0.05）；SDHA表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.428±0.228）（ t=5.02， P<0.05）。实验组UQCR1、COXⅣ和ATP5A的表达水平与阴性对照组相比差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:LINC01133可能通过调控hPDLSC线粒体功能，进而影响hPDLSC成牙骨质分化潜能。

目的:探究血根碱(SAN)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理的人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的影响及机制.方法:将hPDLSCs分为6组:Contro l组、TNF-α组、0.1SAN组、1SAN组、10SAN组和100SAN组,所有hPDLSCs均用成骨诱导培养液培养.除Control组外,其他组细胞培养液中均添加10 ng/mL的TNF-α.0.1 SAN组、1SAN组、10SAN组和100SAN组细胞培养液中分别添加0、0.1、1、10和100μmol/L的血根碱.各组hPDLSCs均在37℃、5％CO2条件下培养21 d.通过可见光比色法检测碱性磷酸酶(ALP)活性.通过茜素红染色观察钙化结节形成,并统计OD562nm(代表钙化结节形成量).通过qRT-PCR检测Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、osterix(OSX)、牙骨质附着蛋白(CAP)、Smad4转录水平.通过 Western blot检测核因子-κB(NF-κB)p65磷酸化水平.结果:与Contro l组比较,TNF-α组细胞的相对ALP活性降低和钙化结节形成量以及RUNX2、OCN、OSX、CAP 和 Smad4 的 mRNA 相对表达量降低(P＜0.05),p-NF-κBp65/NF-κBp65 升高(P＜0.05).与 TNF-α 组比较,1SAN组、10SAN组和100SAN组的相对ALP活性和钙化结节形成量以及RUNX2、OCN、OSX、CAP和Smad4的mRNA相对表达量升高(P＜0.05),p-NF-κB p65/NF-κB p65降低(P＜0.05).结论:血根碱可促进TNF-α处理的hPDLSCs的成骨分化,其机制可能与抑制NF-κB的激活有关,血根碱可能是促进炎性微环境中hPDLSCs成骨分化的候选药物.

目的:探索巨噬细胞(Mφ)极化对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成牙骨质分化的影响及作用机制.方法:将THP-1 人单核细胞分别诱导为M0、M1和M2型Mφ,用RPMI 1640基础培养基或不同极化状态Mφ来源的上清液与成牙骨质诱导液等比例混合制备条件培养基(CM-Control、CM-M0、CM-M1和CM-M2)用于培养hPDLSCs,将条件培养基培养的hPDLSCs形成的细胞膜片包裹人脱矿牙本质基质(TDM)移植至裸鼠皮下进行异位牙骨质形成实验.以CM-Control组作为对照,通过HE染色实验观察类牙骨质样组织的形成;免疫荧光染色(IMF)和qRT-PCR,检测成牙骨质分化标记物骨涎蛋白(BSP)、牙骨质附着蛋白(CAP)和牙骨质蛋白-1(CEMP-1),氧化-抗氧化体系标记物超氧化物歧化酶1(SOD1)和核转录因子红系2相关因子2(NRF2)以及线粒体自噬标记物PTEN诱导假定激酶1(PINK1)和微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)的表达水平.结果:体内实验中,CM-M2组形成的类牙骨质样组织更多,CAP、CEMP-1蛋白表达量更高且伴随SOD1蛋白和PINK1、LC3蛋白表达水平升高,NRF2蛋白未见明显差异.体外实验中,CM-M2组BSP(P＜0.01)、CAP(P＜0.001)和CEMP-1(P＜0.01)的mRNA水平上升,SOD1的mRNA水平上升(P＜0.05),而NRF2的mRNA水平无统计学差异(P＞0.05),PINK1的mRNA水平上升(P＜0.05).结论:M2型Mφ可能通过上调hPDLSCs的氧化-抗氧化体系和线粒体自噬水平促进hPDLSCs的成牙骨质分化潜能.

目的:探讨不良修复体致前牙区残根残冠患者的相关牙周手术治疗及美学再修复,阐明牙周手术治疗配合美学再修复在上前牙区的治疗效果,为其临床治疗方案的制定提供指导.方法:患者上前牙修复后2年余,修复体松动,患牙咬物不适伴牙龈出血,上唇系带附着过高,左上侧切牙根尖区可见低密度影.经牙周、牙体牙髓病和修复等学科会诊,行根管再治疗,牙周基础治疗,并采用牙冠延长术联合系带修整术恢复生物学宽度,引导骨再生术(GBR)联合富血小板纤维蛋白(PRF)修复根尖骨质缺损.术后1个月行暂时冠修复,术后3个月行永久冠修复.结果:术区牙龈及龈乳头形态恢复理想,与邻牙的牙龈高度协调性佳,上唇系带附着正常,中切牙未见明显缝隙;上前牙区修复体形态美观,功能良好;术后跟踪随访X线片显示术区骨密度同邻近骨质相似,已无明显界限.结论:涉及前牙区薄龈型牙龈生物型的美学修复,特别是再治疗的复杂病例,适当的牙周手术治疗手段介入,不但易于获得明显的短期效果,对远期疗效的稳定也有积极的影响.

目的 研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对牙周膜干细胞(PDLSCs)骨向分化及Notch信号通路的影响,初步探讨在TNF-α影响下Notch信号通路对PDLSCs成骨分化的调控作用.方法 采用酶消化结合组织块法获得PDLSCs,通过流式细胞仪检测间充质干细胞(MSCs)表面标记物CD105、CD90、CD146、CD45、CD31的表达,将PDLSCs分为实验组(10 ng·mL-1TNF-α)和对照组(不含TNF-α),使用CCK-8法检测PDLSCs增殖能力;通过碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色、实时定量聚合酶链反应(PCR)检测TNF-α对PDLSCs成骨能力的影响;实时定量PCR检测Notch信号通路受体Notch1、Notch2、Notch3,配体JAG1、JGA2、DLL1,细胞内效应分子Hes-1的表达.结果流式细胞仪检测结果显示CD105、CD90及CD146表达阳性,CD45、CD31表达阴性;CCK-8法结果显示TNF-α能够促进PDLSCs增殖能力(P<0.05);ALP活性检测结果显示,实验组与对照组相比,ALP活性降低(P<0.05);茜素红染色结果显示,与对照组相比,实验组矿化结节减少;实时定量PCR结果显示,与对照组相比,成骨标志基因牙骨质附着蛋白(CAP)、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx2)表达量明显降低(P<0.05);Notch信号通路相关分子中Notch1、Notch2、JAG1、JGA2、Hes-1的表达水平显著降低(P<0.05),而Notch3、DLL1的表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 TNF-α能够促进PDLSCs增殖而抑制其骨向分化,同时抑制Notch信号通路的表达,说明Notch信号通路对PDLSCs骨向分化具有一定的调控作用.

牙周病是最常见的口腔疾病之一,也是成人牙齿丧失的主要原因之一.牙周治疗的目的是实现牙周组织的再生,恢复牙周组织的结构与功能.牙骨质是牙周组织的重要组成,在牙周再生过程中发挥重要的作用,探索牙骨质的特性、构成及牙骨质形成相关因子在牙周组织再生中的作用,尤其是牙骨质特异性蛋白在牙骨质形成中的作用及其用于牙周组织再生的潜能,成为当前牙周再生研究的热点.本文拟就牙骨质的特性、构成和牙骨质特异性蛋白在牙骨质形成以及促进牙周组织再生过程中的作用进行综述.

目的:初步探讨Wnt/β-catenin信号通路对移动性牙根吸收修复的作用.方法:①通过施加过大正畸力建立炎症性牙根吸收大鼠模型,将大鼠随机分为3组,每组10只:牙周膜局部注射氯化锂激活Wnt/β-catenin信号通路组(LiC1组),牙周膜局部注射Dickkopf相关蛋白1抑制Wnt/β-catenin信号通路组(DKK1组)和对照组,并通过Micro-CT扫描对比各组牙根表面陷窝体积变化.②完成扫描后,3组分别随机处死大鼠,并采用免疫组化法分别检测各组大鼠牙周组织中Wnt/β-catenin信号通路的支架蛋白Axin2、胞内β-连锁蛋白β-catenin、重组人骨形态发生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、牙骨质附着蛋白(cementum-derived attachment protein,CAP)和骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)的表达量.结果:①在修复0d时,牙根表面陷窝体积的修复量差异无统计学意义(P＞0.05).2周后LiCl组和对照组的牙根修复体积分数增加明显,仅DKK1组的相应指标出现了减少,3组数据指标变化明显,差异具有统计学意义(P＜0.05).②免疫组化结果显示:在修复0d时,3组各项检测因子表达量无明显差异;修复3d时,3组中BMP-2、BSP和CAP的变化量均差异明显(P＜0.05),LiC1组和DKK1组的β-catenin出现明显差别(P＜0.05);修复第7天后,LiCl组各项检测因子均明显高于DKK1组和对照组(P＜0.05).结论:Wnt/β-catenin信号通路通过调节成骨相关因子Axin2、β-catenin、BMP-2、BSP和CAP的表达,能加快牙根表面吸收陷窝的恢复,加快大鼠移动性牙根吸收后的修复过程.

目的 研究不同浓度的γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对人牙周膜干细胞(hPDLSC)骨向分化的影响.方法 将体外培养的hPDLSC随机分为5组:(1)2个对照组,即hPDLSC组和二甲基亚砜(DMSO)组(加入0.17325μL/L DMSO);(2)3个实验组,分别加入25、50和75μmol/L的DAPT,即DAPT25组、DAPT50组及DAPT75组.通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测不同浓度DAPT对hPDLSC的增殖情况的影响;通过茜素红染色、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)以及蛋白免疫印记法(Western blot)检测不同浓度DAPT对hPDLSC的Notch信号抑制能力及成骨能力的影响.使用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 CCK-8结果显示,DMSO浓度为0.17325μL/L时对hPDLSC的增殖没有明显影响,同时不同浓度的DAPT均会抑制hPDLSC增殖,且DAPT浓度为50μmol/L时对细胞的抑制能力最强(P<0.001);茜素红染色结果显示,hPDLSC组及DMSO组染色明显,矿化结节面积大且颜色深,两组间无明显差异,而3个实验组形成的矿化结节均有所减少,其中DAPT浓度为50μmol/L时较浓度为25及75μmol/L时形成的矿化结节数量更少且矿化结节面积更小;实时荧光定量PCR结果显示,DAPT浓度为50μmol/L时,其成骨标志基因牙骨质附着蛋白(CAP,0.574±0.182)、骨钙蛋白(OCN,0.269±0.100)、Runt相关转录因子2(Runx2,0.470±0.080)的表达量均明显减少,Notch信号通路相关分子Notch1及Hes-1的表达水平分别为0.467±0.118及0.318±0.015,较其余组也有所减少,且DAPT浓度为50μmol/L时的相关成骨标志基因表达量最低(P<0.05),Notch信号通路相关分子Notch1及Hes-1的表达水平也最低(P<0.05);Western blot结果显示,与对照组相比3个实验组Notch、Hes-1及Runx2的蛋白表达量均有减少,其中50μmol/L的DAPT组Runx2的蛋白表达量(0.116±0.006)明显比其它组少,差异有统计学意义(P<0.001).结论 DMSO浓度为0.17325μL/L时对hPDLSC增殖及骨向分化没有明显影响;DAPT可抑制Notch信号通路的传递,从而抑制hPDLSC增殖及骨向分化,同时DAPT浓度为50μmol/L时抑制能力最强.

目的:研究过表达Notch胞内结构域NICD(Notch intracellular domain,NICD)对肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)干扰的牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化的影响,为临床治疗牙周病提供实验依据.方法:选取课题组前期构建的含NICD基因的PDLSCs细胞株(PDLSCs/NICD)及含空载体的PDLSCs细胞株(PDLSCs/K),每种细胞随机分为两组,一组加入浓度为10 ng/ml的TNF-α模拟炎症环境,另一组不加TNF-α,即TNF-α+PDLSCs/K组、TNF-α+PDLSCs/NICD组、PDLSCs/NICD组和PDLSCs/K组.采用茜素红染色、即时定量聚合酶链连锁反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction,rt-qPCR)及蛋白质印迹法(western blot,WB)检测过表达NICD对TNF-α干扰的牙周膜干细胞成骨分化的影响.结果:茜素红染色结果显示,TNF-α+PDLSCs/NICD组矿化结节数量最少且面积最小,明显少于其他3组;rt-qPCR结果显示,TNF-α+ PDLSCs/NICD组成骨标志基因牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein,CAP)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)表达量明显低于其他3组(P＜0.01);WB结果显示TNF-α+PDLSCs/NICD组RUNX2蛋白含量明显少于其他3组(P＜0.01).结论:过表达NICD对TNF-α干扰的PDLSCs的成骨分化能力有双重抑制作用.

目的 探讨超表达Notch胞内结构域(Notch intracellular domain,NICD)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSC)增殖和成骨分化的影响,为牙周病骨缺损的治疗提供依据.方法 以第3代稳定超表达NICD的hPDLSC为实验组,以正常hPDLSC为阴性对照组,转染空载体的hPDLSC为空白对照组,通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测超表达NICD对hPDLSC增殖能力的影响;通过茜素红染色和实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,qPCR)检测超表达NICD对hPDLSC成骨相关基因:牙骨质附着蛋白(cementum attachment proteins,CAP)、骨钙蛋白、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2),Notch信号通路受体Notch1的影响;通过蛋白质免疫印迹法检测超表达NICD对hPDLSC成骨蛋白RUNX2和flag标记蛋白(用以标记NICD)的影响.结果 CCK-8结果显示,3组1～2 d的A值相比差异均无统计学意义(P＞0.05);实验组3～7 d的细胞数量(A值分别为0.203±0.016、0.364±0.014、0.449±0.020、0.549±0.020及0.570±0.020)与其他两组相比显著增加(P＜0.05).茜素红染色结果示,与空白对照组及阴性对照组相比,实验组染色的矿化结节形成范围小颜色浅;qPCR结果显示,实验组14及21 d CAP基因表达量(0.751±0.058、0.887±0.025)、骨钙蛋白基因表达量(0.592±0.051、0.670±0.045)及RUNX2基因表达量(0.319±0.038、0.684±0.055),均较阴性对照组及空白对照组显著降低(P＜0.05),但14及21 d的Notch1表达水平(2.507±0.047、4.041±0.219)显著高于阴性对照组及空白对照组(P＜0.05).蛋白质印迹法结果显示,实验组14及21 d flag标记蛋白表达量(0.167±0.007、0.204±0.010)均显著高于阴性对照组及空白对照组(P＜0.05),但RUNX2的蛋白表达量(0.075 ±0.006、0.074±0.013)均显著低于阴性对照组(0.092±0.003、0.118±0.008)及空白对照组(0.174±0.006、0.212±0.008) (P＜0.05).结论 超表达NICD可以促进hPDLSC的增殖能力,同时抑制其成骨分化.