目的:对穿心莲糖苷水解酶(ApGH)基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达和相对表达量分析.方法:取穿心莲新鲜叶片,提取RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为模板,以穿心莲转录组中筛选到的糖苷水解酶ApGH基因开放阅读框(ORF)设计特异性引物,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,经测序后获得的基因序列利用生物信息学软件预测基因编码蛋白特征,构建原核表达载体在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白质,并利用实时荧光定量PCR分析ApGH基因的表达模式.结果:克隆所得ApGH基因的ORF全长 1734 bp,编码 577个氨基酸(GenBank登录号:OR887606).ApGH为稳定亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,属于糖苷水解酶家族;系统进化分析表明,ApGH归属于GH1 家族.将ApGH基因构建到原核表达载体HIS-MBP-pET28a上,在大肠埃希菌Transetta(DE3)中成功表达出重组蛋白质.实时荧光定量PCR检测结果表明,ApGH基因在叶中表达量最高,茎和根中表达量较低.结论:克隆得到穿心莲ApGH基因并对其蛋白质序列特征进行了系统分析,证明其在大肠埃希菌中成功表达重组蛋白质,且主要在穿心莲叶中表达.研究结果为进一步探索穿心莲糖苷水解酶的催化功能提供了依据.

[目的]为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492 的生物学功能.[方法]对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492 主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达.利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能.[结果]几丁质酶AO-492 有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18 家族结构域,并含有糖苷水解酶 18 家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构.系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近.SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492 分子量约为 59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应.ReAO-Z492 最适温度为 40℃,最适pH为 7.0;Mg2+对其酶活有促进作用,而Ag+、Cu2+、Fe3+和Zn2+有抑制作用.ReAO-Z492 对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性.[结论]少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用.

猪苓与蜜环菌建立共生关系时,猪苓菌丝会反侵染并消解蜜环菌菌索,以获取营养物质,糖苷水解酶是参与这一过程的主要酶类之一.本研究从猪苓转录数据库中获得糖苷水解酶家族基因42 类、309 个;其编码的糖苷水解酶蛋白含各类结构域 344 个,以糖苷水解酶结构域 glyco_hydro为主,共计 35 类 173 个.对猪苓糖苷水解酶进行的gene ontology(GO)功能注释结果表明,这些蛋白参与的生物学过程以物质代谢及分解过程为主,特别是多糖等大分子物质代谢;181 个猪苓糖苷水解酶具有水解酶活性,这些水解酶活性呈多样性分布.与未被蜜环菌侵染的猪苓部位相比,43 个糖苷水解酶基因在蜜环菌侵染的菌核部位中差异表达,编码包括 glyco_hydro_48、cellulase 和polysacc_deac_1 等功能结构域,可能发挥水解几丁质、纤维素酶活性及免疫调节等活性,这为猪苓与蜜环菌互作关系的研究提供了候选基因及蛋白.

目的 分析慢性牙周炎患者龈下菌斑宏转录组,探究慢性牙周炎新的发病机制.方法 选取航空总医院口腔诊疗中心2015年3月至2016年12月收集的20例慢性牙周炎患者为观察对象,采集龈下菌斑提取其中RNA,应用高通量的二代测序技术,对其宏转录组进行分析,观察慢性牙周炎发生、发展过程中明显与之相关的基因表达情况.结果 慢性牙周炎患者的龈下菌斑中主要细菌共7种,占细菌总量的28.1％,其中文氏密螺旋体占12.4％、齿垢螺旋体占3.6％、牙龈二氧化碳噬纤维菌占2.8％、牙髓卟啉单胞菌占2.6％、普雷沃菌占2.6％、梅毒螺旋体占2.1％、中间普氏菌占2.0％,而螺旋体含量最高,为18.1％;与牙周炎发生关系密切的同源蛋白质家族中,最多的表达基因序列与细菌的翻译相关超过5000条;数量最多的基因数量集中于精氨酸、脯氨酸代谢通路上,有1149条与之相关;而碳水化合物活性酶相关的基因表达中,表达最多的是碳水化合物相关结构域基因序列和糖苷水解酶基因序列多达43以及34,多糖裂解酶表达为0.结论 慢性牙周炎龈下菌斑中,螺旋体的基因序列高度表达.细菌感染机体后,细菌翻译活动占了主要作用,对于对细菌生长代谢起主导作用的碳水化合物的利用上,细菌则表现出对于普通的单糖、双糖相较于多糖更多的基因表达.

木聚糖是植物细胞中含量最高的半纤维素,是一种重要的微生物资源,也是自然界中含量丰富的多糖之一.木聚糖酶是能够将复杂的木聚糖结构水解为木寡糖的一类酶系,按其结构域可分为不同的家族,其中大部分木聚糖酶属于糖苷水解酶的10和11家族,而11家族的木聚糖酶由于分子量较小,比酶活较高等诸多优点使其在饲料、造纸、食品、能源工业有着广阔的应用前景.但是商业化木聚糖酶必须易于生产,酶活较高,并且能够适应工业过程中的各种严格条件,例如饲料与造纸工业过程中有时需要瞬时提高反应温度,这就要求参与这一系列反应的木聚糖酶在高温下有着较高的比酶活和热稳定性.但是一般条件下,很多微生物分泌的木聚糖酶达不到此要求,因此,通过合理的分子生物学方法提高木聚糖酶的热稳定性使其在工业生产中发挥更大的作用是人们不断追求的目标.本文重点阐述二硫键、糖基化、疏水作用等蛋白的重要性质,结合作者自身实验结果,讨论了这些性质对11家族木聚糖酶热稳定性的影响.为进一步加深木聚糖酶作用机制的了解、指导木聚糖酶的分子改良有提供参考.

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(dispersinB,DspB)是一种活性高、稳定性强的糖苷水解酶,其相对分子质量为40 000. DspB由361个氨基酸残基组成,具有8个β/α结构域,折叠后形成TIM桶状结构.其中,β4结构域存在高度保守的位点Asp 183和Glu 184.作为糖苷水解酶家族20(glycoside hydrolase family 20,GH20)成员,DspB不像其他β-己糖胺酶那样具有多个功能域,DspB只有单一的功能域,且具有独特的底物专一性、底物结合与释放特性.由于DspB能够水解细菌生物被膜基质中的聚β-(1,6)-N-乙酰葡萄糖胺(poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine,PNAG),使生物被膜发生解聚而变成游离状态,增加抗生素疗效,因此有望用于细菌引起的植入医疗器械感染的治疗.现分别从DspB所在GH20家族成员概况、DspB的结构和DspB的功能与应用三个方面对相关的最新研究进展进行分析与总结.

几丁质作为有机框架主要成分参与贝壳的形成.β-N-乙酰-己糖胺酶(Beta-hexosaminidase/Beta-N-acetylhexosaminidase,HEX)属于糖苷水解酶家族20,在几丁质水解过程发挥重要作用.为了探究PmHEXL在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究利用RACE技术克隆获得PmH EXL基因cDNA全长序列并检测其在不同组织的表达模式.研究显示,PmH EXL基因序列全长2 760 bp,其中5'UTR为167 bp,3'UTR为268bp,开放阅读框(ORF)为2 325bp,编码774个氨基酸:预测其相对分子量为89.59kD,理论等电点为5.93;SMART软件分析PmHEXL蛋白质序列,发现它具有典型的GH20、GH20b结构域和CHB-HEX结构域;多序列比对结果显示PmHEXL与其它物种的HEX具有较高的保守性;qPCR表达分析显示PmH EXL在外套膜套膜区表达量最高,边缘区次之.综上所述,PmHEXL可能参与马氏珠母贝贝壳的形成过程.

革兰氏阴性结合蛋白(Gram-negative bacteria binding proteins,GNBPs)是昆虫天然免疫系统中的一类重要模式识别受体,在识别病原微生物表面的相关分子模式中发挥着重要作用.为了解模式识别蛋白GNBP如何免疫应答病原微生物应激,本研究利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得斜纹夜蛾革兰氏阴性结合蛋白GNBP1基因(SlGNBP1).斜纹夜蛾SlGNBP1基因(GenBank登录号:JF313110)全长cDNA序列为1 448 bp,开放阅读框(ORF)序列长1 302 bp,编码433个氨基酸残基.生物信息学分析序列表明SlGNBP1蛋白序列含有βGRP(β-1,3-glucan recognition protein)家族特有的保守性结构域,即糖苷水解酶活性结构域(Glyco_hydro_ 16),有3个N-糖基化位点,19个O-糖基化位点,42个磷酸化位点.系统进化树和同源性分析表明斜纹夜蛾SlGNBP1基因与其它鳞翅目昆虫的βGRP1基因的同源性很高,其中,斜纹夜蛾SlGNBP1基因与棉铃虫和柑橘凤蝶的βGRP序列相似度最高,相似度分别为79％和66％,S1GNBP1蛋白序列中有4个保守的半胱氨酸位点,富含12个色氨酸,由于两个葡聚糖酶活性位点突变而失去葡聚糖酶活性.利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测斜纹夜蛾SlGNBP1基因的时空表达模式,结果表明SlGNBP1基因在斜纹夜蛾整个发育历期都表达,其中4龄幼虫表达量最高;组织分布表明SlGNBP1基因在斜纹夜蛾的表皮、脂肪体、中肠、卵巢和血细胞中均有表达,其中脂肪体为主要表达部位.将绿僵菌、玫烟色棒束孢、金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和粘质沙雷氏菌6种病原微生物分别注射4龄斜纹夜蛾幼虫后,对SlGNBP1基因进行mRNA水平检测.RT-qPCR检测表明SlGNBP1在不同诱导时间点与对照相比,均呈现明显上调表达,但诱导程度不同,诱导18-24 h后达到峰值,且SlGNBP1基因对粘质沙雷氏菌最为敏感,与对照相比提高了约100倍.以上结果表明SlGNBP1基因可能在斜纹夜蛾先天免疫应答反应中通过识别病原微生物表面的相关分子模式而发挥作用,可能成为斜纹夜蛾生物防治的新靶标.

高卢蜜环菌是一种兼性寄生真菌,在天麻栽培过程中作为天麻的唯一营养源.几丁质酶作为一种糖苷水解酶,在高卢蜜环菌的生长发育及其与天麻的共生过程中发挥重要作用.高卢蜜环菌几丁质酶基因共有22条,对这些几丁质酶基因的氨基酸序列进行生物信息分析,发现有12条几丁质酶基因均含有糖苷水解酶18家族(GH18)结构域.对高卢蜜环菌、奥氏蜜环菌、天麻、酿酒酵母和哈茨木霉的几丁质酶氨基酸序列进行系统进化分析,进一步预测高卢蜜环菌中几丁质酶基因功能.利用独角金内酯类似物GR24诱导高卢蜜环菌分枝,并分析22条几丁质酶基因的表达模式,发现8条基因可能参与蜜环菌分枝、细胞壁降解和重塑等生理过程.

分离克隆栽培香蕉中的几丁质酶基因ChiI2,构建超表达载体和干涉表达载体,可为进一步研究ChiI2基因响应抗逆胁迫的功能提供基础.从栽培香蕉天宝蕉(Musa spp.,AAA)中克隆几丁质酶基因ChiI2,利用生物信息软件对该基因进行分析,并用无缝克隆技术分别构建ChiI2的超表达载体和干涉表达载体.从香蕉果皮中克隆到一个几丁质酶基因ChiI2,该基因全长942 bp,蛋白编码313个氨基酸,其编码的蛋白质理论分子量(Mr)为32.96,等电点(pI)为6.77.ChiI2蛋白的α-螺旋结构有6个,β-折叠结构有5个,转角结构有33个.蛋白质疏水性预测分析值为-0.233,属于亲水性蛋白.功能保守域分析表明,该蛋白是糖苷水解酶家族几丁质酶家族的一员.该基因核苷酸序列推导的氨基酸与野生香蕉、玉米、水稻、小麦、莲等植物的同源性都在70％以上.对ChiI2基因进行荧光定量PCR检测,发现4℃处理6h的表达显著高于对照和38℃处理6h,表明ChiI2基因可能与低温响应有关,诱导香蕉苗产生抗冷性.利用无缝克隆技术成功构建了pGreenⅡ-ChiI2超表达载体和pGreenⅡ-ChiI2i干涉表达载体,并转化到农杆菌EHA105菌株中.本研究成功地从栽培香蕉天宝蕉中分离克隆到了ChiI2基因,并对其基因特点和蛋白功能进行了预测分析,成功构建了超表达载体和干涉表达载体,可为进一步研究其功能奠定基础,也为采用基因工程方法改良选育香蕉抗寒品种提供了新尝试.