目的:对穿心莲糖苷水解酶(ApGH)基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达和相对表达量分析.方法:取穿心莲新鲜叶片,提取RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为模板,以穿心莲转录组中筛选到的糖苷水解酶ApGH基因开放阅读框(ORF)设计特异性引物,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,经测序后获得的基因序列利用生物信息学软件预测基因编码蛋白特征,构建原核表达载体在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白质,并利用实时荧光定量PCR分析ApGH基因的表达模式.结果:克隆所得ApGH基因的ORF全长 1734 bp,编码 577个氨基酸(GenBank登录号:OR887606).ApGH为稳定亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,属于糖苷水解酶家族;系统进化分析表明,ApGH归属于GH1 家族.将ApGH基因构建到原核表达载体HIS-MBP-pET28a上,在大肠埃希菌Transetta(DE3)中成功表达出重组蛋白质.实时荧光定量PCR检测结果表明,ApGH基因在叶中表达量最高,茎和根中表达量较低.结论:克隆得到穿心莲ApGH基因并对其蛋白质序列特征进行了系统分析,证明其在大肠埃希菌中成功表达重组蛋白质,且主要在穿心莲叶中表达.研究结果为进一步探索穿心莲糖苷水解酶的催化功能提供了依据.

[目的]为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492 的生物学功能.[方法]对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492 主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达.利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能.[结果]几丁质酶AO-492 有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18 家族结构域,并含有糖苷水解酶 18 家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构.系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近.SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492 分子量约为 59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应.ReAO-Z492 最适温度为 40℃,最适pH为 7.0;Mg2+对其酶活有促进作用,而Ag+、Cu2+、Fe3+和Zn2+有抑制作用.ReAO-Z492 对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性.[结论]少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用.

几丁质酶是降解几丁质的糖苷水解酶,参与昆虫蜕皮、器官发育、免疫等重要生理过程.目前,寄生蜂等膜翅目昆虫中几丁质酶的鉴定以及功能研究仍较少.本研究基于生物信息学分析,在丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis基因组中鉴定到14个几丁质酶基因,氨基酸个数介于312～2 682之间.系统进化分析表明丽蝇蛹集金小蜂几丁质酶分为9个亚家族,其中Group Ⅳ、Ⅶ亚家族可能通过基因串联复制而发生基因家族扩增.qRT-PCR分析结果表明几丁质酶基因的表达具有多样性,其中NvCht1、NvCht5、NvCht6、NvCht7 4个基因在1.5 d幼虫表达量最高,NvCht3在5 d幼虫表达量最高,NvCht8在幼虫期高表达.此外,幼虫组织中的表达分析结果表明NvCht4、NvCht5、NvCht10、NvCht12 在表皮中高表达,NvCht7、NvCht8、NvCht13 在肠道中高表达,NvCht9 在脂肪体和表皮中高表达,NvCht11在唾液腺中高表达.本研究为寄生蜂几丁质酶的进化分析以及功能研究提供理论基础.

木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH)属于糖苷水解酶16家族(GH16),是一类介导木葡聚糖(XyG)-纤维素骨架构建和重组的酶.为探明XTH家族基因在金鱼草(Antirrhinum majus)中的潜在生物学功能,通过生物信息学分析,结合转录组测序(RNA-seq)和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)探究了 XTH家族基因分别在金鱼草瓣化和非瓣化雄蕊以及抗感核盘菌材料中的表达水平.结果表明,鉴定出的33个AmXTH蛋白主要保守基序为ExDxE,分为3个亚组.AmXTH基因启动子的顺式作用元件多为生长发育、抗病及抗逆类.经RNA-seq和qRT-PCR验证,最终挖掘出4个正向介导抗病的关键候选基因(AmXTH3、14、18和33),1个负向介导抗病的关键候选基因(AmXTH23),12个正向介导雄蕊瓣化的关键候选基因(AmXTH 1、7、9、11、21、22、23、24、26、28、29和33)以及2个负向介导雄蕊瓣化的关键候选基因(AmXTH15和31);其中AmXTH23和AmXTH33可能同时在金鱼草抗核盘菌和雄蕊瓣化中发挥作用.该研究初步挖掘出参与金鱼草抗核盘菌及雄蕊瓣化的AmXTH候选基因,为进一步揭示其生物学功能奠定了基础.

猪苓与蜜环菌建立共生关系时,猪苓菌丝会反侵染并消解蜜环菌菌索,以获取营养物质,糖苷水解酶是参与这一过程的主要酶类之一.本研究从猪苓转录数据库中获得糖苷水解酶家族基因42 类、309 个;其编码的糖苷水解酶蛋白含各类结构域 344 个,以糖苷水解酶结构域 glyco_hydro为主,共计 35 类 173 个.对猪苓糖苷水解酶进行的gene ontology(GO)功能注释结果表明,这些蛋白参与的生物学过程以物质代谢及分解过程为主,特别是多糖等大分子物质代谢;181 个猪苓糖苷水解酶具有水解酶活性,这些水解酶活性呈多样性分布.与未被蜜环菌侵染的猪苓部位相比,43 个糖苷水解酶基因在蜜环菌侵染的菌核部位中差异表达,编码包括 glyco_hydro_48、cellulase 和polysacc_deac_1 等功能结构域,可能发挥水解几丁质、纤维素酶活性及免疫调节等活性,这为猪苓与蜜环菌互作关系的研究提供了候选基因及蛋白.

[背景]β-半乳糖苷酶转糖苷活性弱,产物低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)易被水解,致其催化得率普遍较低.[目的]以GH42 家族Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB为对象,探讨家族保守氨基酸位点突变对β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响.[方法]在单点突变体功能研究基础上,采用定点突变与化学修饰相结合的方法,对保守氨基酸位点E303 与F341 进行累积突变.[结果]与野生型酶相比,所构建双点突变体Ox-E303C/F341S水解活性降低为 30%;GOS最大得率由 0.75%提高到 19.50%.[结论]家族保守氨基酸位点累积突变能够使单点突变体功能得到共同进化,降低 β-半乳糖苷酶水解活性和底物抑制作用,能够提高其转糖苷催化活性.

[背景]糖苷水解酶 13 家族(glycoside hydrolase family 13,GH13)是已知最大的α-淀粉酶家族,不含有半乳糖苷酶.[目的]对海洋细菌潮滩发光杆菌(Photobacterium gaetbulicola)的一个蛋白BgalPg进行鉴定.[方法]通过保守位点分析和系统发育树确定BgalPg蛋白的家族分类;通过克隆、表达和纯化测定重组BgalPg蛋白的酶学性质并鉴定功能.[结果]BgalPg的蛋白序列新颖,与已知的碳水化物酶无同源性.序列分析结果表明该蛋白具有 GH13 家族的典型特性,并且隶属于GH13_38亚家族.BgalPg对α-淀粉酶家族酶的相关底物均无催化活性,却能水解含有β-半乳糖苷键的底物pNP-β-Gal[(2.8±0.4)U/mg]和oNP-β-Gal[(1.4±0.3)U/mg],并且能水解乳糖[(0.40±0.01)U/mg],表现出典型的β-半乳糖苷酶活性.同时,该酶在pH 7.0-8.5 稳定性好,60℃的半衰期为 1.5 h.[结论]发现隶属于GH13 家族的β-半乳糖苷酶.

[背景]纹枯病是水稻最重要的病害之一,目前对其病菌致病机制的研究还较少.[目的]鉴定更多水稻纹枯病菌致病基因,为纹枯病的防治提供理论依据.[方法]采用 3′-RACE方法获得RsPG5 基因全长,并使用 ExPASy 等在线软件对其编码产物的结构及生物学特性进行分析,测定其编码产物的致病功能.[结果]RsPG5 具有 7 个外显子和 6 个内含子,编码区全长 1263 bp,可编码 420 个氨基酸.编码产物为糖苷水解酶 GH28 家族成员,具有真菌多聚半乳糖醛酸酶特有的保守序列NTD、DD、GHG和RF(I)K,并且有一个含 15 个氨基酸的信号肽;二级结构由α-螺旋、β-折叠和随机卷曲螺旋构成,并且可形成 4 个二硫键;三级结构为由 α-螺旋、β-折叠和随机卷曲螺旋按右手螺旋规则形成的具有裂隙区的特定空间结构,裂隙区可能负责着其酶活功能.生物学性质预测表明,RsPG5 为稳定、易溶于水的外泌性蛋白,主要定位于细胞壁、液泡和线粒体.RsPG5具有明显的多聚半乳糖醛酸酶活性,可分解果胶,破坏水稻叶鞘细胞;针刺接种分蘖末期水稻叶鞘,72 h后可形成明显的褐色坏死斑;将纹枯病菌接种至水稻叶鞘,在病菌致病过程中RsPG5 可上调表达.[结论]RsPG5 是一个典型的多聚半乳糖醛酸酶蛋白,为水稻纹枯病菌的重要致病因子.

目的 分析慢性牙周炎患者龈下菌斑宏转录组,探究慢性牙周炎新的发病机制.方法 选取航空总医院口腔诊疗中心2015年3月至2016年12月收集的20例慢性牙周炎患者为观察对象,采集龈下菌斑提取其中RNA,应用高通量的二代测序技术,对其宏转录组进行分析,观察慢性牙周炎发生、发展过程中明显与之相关的基因表达情况.结果 慢性牙周炎患者的龈下菌斑中主要细菌共7种,占细菌总量的28.1％,其中文氏密螺旋体占12.4％、齿垢螺旋体占3.6％、牙龈二氧化碳噬纤维菌占2.8％、牙髓卟啉单胞菌占2.6％、普雷沃菌占2.6％、梅毒螺旋体占2.1％、中间普氏菌占2.0％,而螺旋体含量最高,为18.1％;与牙周炎发生关系密切的同源蛋白质家族中,最多的表达基因序列与细菌的翻译相关超过5000条;数量最多的基因数量集中于精氨酸、脯氨酸代谢通路上,有1149条与之相关;而碳水化合物活性酶相关的基因表达中,表达最多的是碳水化合物相关结构域基因序列和糖苷水解酶基因序列多达43以及34,多糖裂解酶表达为0.结论 慢性牙周炎龈下菌斑中,螺旋体的基因序列高度表达.细菌感染机体后,细菌翻译活动占了主要作用,对于对细菌生长代谢起主导作用的碳水化合物的利用上,细菌则表现出对于普通的单糖、双糖相较于多糖更多的基因表达.

木聚糖酶是一种备受关注的糖苷水解酶,能够应用于酿造、饲料、制药、生物能源等多个领域,但是目前大部分木聚糖酶在低于30℃的环境中活力较低.为了获得在较低温度下具有高活力的木聚糖酶,从青霉L1 (Penicilliumsp.L1)中克隆到一条GH11木聚糖酶基因XYN11A,并在毕赤酵母GS115中进行异源表达.经过纯化和酶学性质测定,该酶的最适pH和最适温度分别为3.5-4.0和55℃,能够在酸性和中性缓冲液(pH 1.0-7.0)中以及40℃下保持稳定,同时对所有已测试的金属离子和化合物都有一定的抗性.值得注意的是,该酶具有GH11家族中比较高的比活力6 700 U/mg,另外,该酶在较低温度20-40℃亦可展现出较高的酶活力(24％-58％).经过16h的榉木木聚糖水解实验,该木聚糖酶的水解产物主要是木二糖、木三糖和木四糖,几乎不产生单体木糖.因该酶同时具有产寡糖、较低温度下活力高以及嗜酸性等3种特性,XYN11A在食品和饲料工业中具有巨大的应用潜力.