本研究依托桧状青霉的基因组学和蛋白组学数据,发现一种新型的阿魏酸酯酶.利用PCR 技术成功扩增得到桧状青霉阿魏酸酯酶的基因,构建真菌表达盒通过原生质体的方法将其转化到黑曲霉中.通过 SDS-PAGE 检测和酶活力检测验证该阿魏酸酯酶成功地在黑曲霉胞外分泌表达.根据氨基酸序列相似性和底物特异性分析都显示该阿魏酸酯酶属于C 型的阿魏酸酯酶,与常见的A 型、B 型阿魏酸酯酶性质区别较大.将成功表达阿魏酸酯酶的黑曲霉胞外酶液复配里氏木霉酶液后,水解不同生物质材料,纤维素水解效率均有大幅程度地提高,玉米秸秆,麦麸,玉米芯,木薯酒糟的水解效率分别提高68.8％,38.6％,15.6％和 20.0％.该研究为新颖阿魏酸酯酶应用以及今后里氏木霉纤维素酶酶系复配提供新的思路.

天然的木质纤维素材料含有纤维素、半纤维素和木质素等成分.降解天然木质纤维素底物时,需要木质纤维素酶共同作用.近年在木质纤维素酶的相互协同作用方面的研究引起人们的关注,成为一个新的研究热点,文中使用两个不同的共表达载体pETDuet-1和pRSFDuet-1,在大肠杆菌中共表达了白蚁及其肠道微生物来源的p-葡萄糖苷酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、漆酶和木聚糖酶这4种木质纤维素酶,经过SDS-PAGE分析得到了与理论值一致的蛋白条带,同时经过酶活验证,这4种蛋白都具有酶活性.以磷酸处理的微晶纤维素(PASC)为底物,测定了共表达酶粗酶液与单独表达酶混合液的协同作用因子,从还原糖的产量上经计算共表达的粗酶液比单独表达酶的混合液对PASC的降解协同作用提高44％;以滤纸和磷酸处理的玉米芯为底物,测定降解协同作用,分别提高了34％和20％.结果 表明,共表达酶的降解效率要高于混合的单组分酶液降解效率的总和.

利用农业废弃物玉米芯酶解液替代葡萄糖作为碳源, 棉籽粕替代酵母膏作为氮源发酵生产D-乳酸.结果表明:在初始还原糖质量浓度为100 g/L (葡萄糖88.5 g/L, 木糖11.5 g/L) 、棉籽粕3.5 g/L、每升发酵体积添加3 U的中性蛋白酶以及pH 6.5的情况下, 采取补料发酵措施, 菌株Sporolactobacillus sp.YBS1-5在90 h内产生了111.8 g/L的D-乳酸, 糖酸转化率为87％, 光学纯度达98％以上, 生产强度达1.24 g/ (L·h) .本文提供了一种利用农业废弃物发酵产D-乳酸的新途径.

为从环境中分离出能够降解木聚糖的微生物,利用富集培养法从猪粪与甘蔗叶混合发酵堆肥中分离到一个具有木聚糖降解能力,能够利用玉米芯作为惟一碳源的混合菌群.高通量测序分析发现该菌群具有丰富的微生物多样性,其中未知微生物的含量约为50.8％.该菌群发酵液中的木聚糖酶在以AZO-xylan(Birch-wood)为底物时,其最适反应温度为55 ℃,最适反应pH为8.0,在55℃以下能够保持很好的稳定性.重要的是,该菌群的发酵液能够直接水解玉米芯生产木三糖和木四糖,从而省去了碱处理玉米芯制备木聚糖的步骤,进而降低了环境污染以及生产成本.

以白腐真菌落叶松锈迷孔菌(Porodaedalea laricis)胞外漆酶为响应值,通过将Plackett-Burman设计、最陡爬坡设计和Box-Behnken设计相结合,获得了P.laricis产胞外漆酶的最适培养基为:去皮马铃薯365.61 g/L、蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.15 g/L、CaCl2·2H2O 0.03 g/L、酒石酸铵6.68 g/L、琥珀酸钠1.5 g/L、吐温800.48 mL/L、玉米芯46.43 g/L、维生素B10.01 g/L.在该条件下,P.laricis漆酶活性为3.29 U/mL,相比于优化前提高了2.81倍,与理论值3.32 U/mL相近,说明该模型准确可靠.此外,将漆酶应用于降解多种合成染料包括活性亮蓝X-BR、雷马素亮蓝R、酸性黑172、刚果红、亚甲基蓝、中性红、靛蓝、萘酚绿B和结晶紫,反应168 h后脱色率分别可达到95.64％、97.21％、36.11％、91.63％、61.42％、74.65％、48.60％、25.13％ 和68.80％.

筛选和鉴定可降解木质纤维素的真菌,并研究其产酶特征.采用刚果红平板涂布法,从荔枝腐叶中筛选具有木质纤维素降解能力的真菌,结合ITS-rDNA序列分析进行鉴定,初步测定其产酶条件,然后采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析与Sephadex G-100凝胶层析对硫酸铵沉淀的粗酶液进行分离纯化,对其开展酶学性质研究.结果显示,筛选出一株可降解木质纤维素降解的菌株YB,鉴定为绿木霉(Trichoderma virens).在发酵过程中,纤维素酶和木聚糖酶的最大活力分别为313.53±26.78 U/mL和18120.87±500.37 U/mL.分离纯化得到纤维素酶(CMC酶)Ⅰb、Ⅳ和木聚糖酶Ⅰa;通过SDS-PAGE检测,其分子量分别为58.5 kD、22.8 kD和44.5 kD.3种酶的最适酶促反应条件均为:50℃,pH 5.0.其中,木聚糖酶能有效降解玉米芯木聚糖为木糖和多种木寡糖.菌株Trichoderma virens YB可分泌高效木质纤维素降解酶,具有应用于木聚糖酶和木寡糖生产的潜力.

[目的]为研究HcLPMO的活性测定方法及其与纤维素酶的协同降解特性.[方法]利用大肠杆菌表达系统进行HcLPMO异源表达,研究以AmplexTM Ultra Red为荧光底物的LPMOs活性检测条件;研究HcLPMO与纤维素酶最优配比协同降解微晶纤维素及其他多种生物质底物的能力.[结果]表达条件确定最适装液量为20％,最适诱导温度为20℃.活性测定研究结果表明HcLPMO需先与铜离子结合才具有活性,电子供体抗坏血酸钠(ASC)最适浓度为10-4mol/L,并发现AmplexTM Ultra Red浓度以及辣根过氧化物酶浓度对酶活的检测影响较小.HcLPMO与纤维素酶协同降解微晶纤维素研究确定HcLPMO与纤维素酶最优配比为2∶3,葡萄糖产量相较纤维素酶单独作用提高了99.48％.此外,针对多种生物质底物,发现该酶与纤维素酶的复配体系对汽爆玉米秸秆和微晶纤维素的协同降解效果较好,相较于单独用纤维素水解酶,葡萄糖产量分别提高了63.81％和59.43％,而对碱处理玉米芯和木薯渣降解效果次之,葡萄糖产量仅分别提高35.41％和11.06％.[结论]HcLPMO与纤维素酶复配能够有效提高酶法降解纤维素效率;而底物前处理如蒸汽爆破或碱处理对于HcLPMO与纤维素酶协同降解木质纤维素影响较大.

为探索贵州不同香菇菌株产漆酶能力,得到高产漆酶的栽培基质,从而为提高和改善香菇的产量和品质奠定理论基础,助推贵州香菇产业振兴.试验以贵州香菇主栽品种香菇808、庆科R20以及贵州特有马桑香菇为研究对象,通过拮抗反应、系统发育树及温度试验,对香菇菌株进行了区别性鉴定,并以香菇的主要栽培基质为诱导物,研究3种不同香菇菌株液体发酵产漆酶活性连续12 d的变化规律.马桑香菇、香菇808和庆科R20虽均同为香菇属的下属分支,但菌株间是有区别的,存在一定种源差异.香菇液体产漆酶活性受菌株遗传差异和4种不同诱导培养基的影响均为极显著(P<0.001),且各处理下漆酶均呈现先升后降的趋势.在培养初期,所有处理下香菇产漆酶活性均较低,在培养中后期漆酶活性较高,峰值也主要集中在第8-11天内.相对菌株庆科R20和马桑香菇,香菇808在含玉米芯、马桑木屑及青杠木屑的诱导培养基中液体产漆酶能力均为最强,最大酶活分别为464.06、238.64、288.94 U/L.而麦麸对庆科R20的诱导力更强,最大酶活达265.07 U/L;麦麸对诱导马桑香菇产漆酶的时间最为集中且反应迅速,最大酶活达161.83 U/L,但高水平诱导力更持久的是马桑木屑,最大酶活达108.61 U/L.香菇808、庆科R20和马桑香菇3种菌株间是有区别的,存在一定种源差异,且从产漆酶水平上看,香菇808、庆科R20和马桑香菇对4种基质木质素降解吸收能力差异较大,最佳基质分别为玉米芯、麦麸和马桑木屑.

以Azo-xylan为底物,利用双层平板法从堆肥中筛选到可降解木聚糖的菌株,16S rRNA测序分析显示该菌株与糖丝菌属(Saccharothrix variisporea)的同源性最高(99.33％),命名为S.variisporea YJ.研究发现以酵母提取物或(NH4)2SO4作为氮源、甘蔗叶作为碳源、初始pH值7.0、发酵温度40℃、发酵时间5 d时,发酵液中木聚糖酶的酶活性最高.酶学性质研究表明该木聚糖酶的最适反应温度及pH值分别为55℃和8.0,在55℃以下及pH值4.0～10.0的范围内保持较高稳定性.Na+能有效提高木聚糖酶活性,Mg2+和Mn2+没有明显影响,Cu2+则严重抑制木聚糖酶活性.此外,发酵液还可以直接对天然底物玉米芯进行降解.