[目的]为挖掘新型裂解性多糖单加氧酶(LPMO)酶资源,探究LPMO在辅助降解纤维素过程中起到的重要作用.[方法]从Thermothelomyces thermophilus基因组中克隆表达了一个新型LPMO酶TtLPMO9I,系统地分析了其序列及结构的进化特征;采用DNS法表征了TtLPMO9I的酶学性质;在反应体系中添加不同浓度的抗坏血酸探究外部电子供体对TtLPMO9I活性的影响;以玉米秸秆和微晶纤维素为底物,通过检测还原糖的生成量计算获得TtLPMO9I与纤维素酶的协同作用效果.[结果]TtLPMO9I在 60℃,pH 5.0 时表现出最佳酶活力.在 60℃孵育 12 h后,仍能剩余 54%的活性.经pH 6.0-8.0 处理 12 h后,酶活无损失.添加外部电子供体抗坏血酸使TtLPMO9I的活性提高至 184%.在玉米秸秆和微晶纤维素降解过程中,TtLPMO9I与纤维素酶表现出良好的协同作用效果.将 50-200 μg的TtLPMO9I添加至降解体系中,还原糖产量分别提高了 34%-142%和 6%-46%.[结论]TtLPMO9I不仅具有良好的温度稳定性和pH稳定性,在木质纤维素的降解过程中也具有突出的作用效果,为工业生产应用提供了潜在的优质酶资源.

目的:脓毒症是一种宿主对感染的反应失调,具有病死率高的特点,目前的治疗方法难以达到满意的疗效.研究表明臭氧治疗因其具有加强抗感染和免疫调节的作用,在多种感染及炎症相关疾病中起治疗作用.臭氧油是重要的臭氧治疗方式,其中关键成分为酸化脂肪酸酯.而酸化脂肪酸酯在脓毒症中的作用并不明确.本研究旨在探索酸化脂肪酸酯在脓毒症小鼠模型中的作用及其分子机制.方法:利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射及盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)构建小鼠脓毒症模型,取小鼠血清检测炎症因子,采集肺组织进行苏木精和伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色,评估不同时间点及不同剂量酸化脂肪酸酯对脓毒症炎症因子释放及相关肺损伤的影响.在构建脓毒症模型后观察96 h,分析小鼠存活率.此外,用酸化脂肪酸酯处理原代腹腔巨噬细胞、人急性单核细胞白血病细胞系THP-1,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定炎症因子水平,蛋白质印迹法检测半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)和下游消皮素D(gasdermin-D,GSDMD)蛋白的裂解.结果:不同时间和剂量的酸化脂肪酸酯处理均可减少脓毒症小鼠炎症小体相关细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18的释放(均P<0.05),但对细胞因子IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的释放无显著影响(均P>0.05).酸化脂肪酸酯可显著提高脓毒症小鼠存活率,减轻脓毒症小鼠肺损伤(均P<0.05).酸化脂肪酸酯可抑制经典及非经典途径诱导的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体活化(均P<0.05),但不影响黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)和含NLR家族CARD结构域4(NLR family CARD domain-containing protein 4,NLRC4)炎症小体的活化(均P>0.05).酸化脂肪酸酯可抑制caspase-1和下游GSDMD的裂解.结论:酸化脂肪酸酯通过减少炎症因子释放及脓毒症相关器官损伤进而在脓毒症中起到保护作用,其机制为酸化脂肪酸酯抑制NLRP3炎症小体的活化,提示酸化脂肪酸酯可作为一种治疗脓毒症潜在的候选药物.

多糖单加氧酶(Polysaccharide monooxygenases,PMOs)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子(如维生素C)存在下可使纤维素分子氧化降解,在纤维素的酶解中起重要作用.本研究克隆5个嗜热真菌PMOs基因,构建pPICZaA-PMO表达载体,电转毕赤酵母GS115进行真核表达,经镍柱纯化获得重组蛋白后对其氧化活性进行探究.用5个PMOs分别处理磷酸膨胀纤维素(PASC),薄层层析法(TLC)鉴定酶解产物主要为纤维二糖到纤维六糖;飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)鉴定结果显示:PMO0810为C4或C6氧化,PMO2033、PMO0154、PMO4983既有C1氧化也有C4或C6氧化,PMO3424未检测到相应的氧化裂解峰.

溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)是近些年才发现的一种蛋白,能够催化多糖葡萄糖苷键的氧化裂解,显著促进丝状真菌纤维素酶系对木质纤维素的降解作用.本综述对溶解性多糖单加氧酶发现过程、晶体结构、反应机制、活性位点和区域选择性、与纤维素酶的协同作用等方面分别进行了阐述,并对溶解性多糖单加氧酶对于木质纤维素降解方面的应用进行了论述.

多糖单加氧酶(polysaccharide monooxygenase,PMO)是一种铜离子依赖的氧化酶,属于辅助活性酶类第九家族(auxiliary activity 9,AA9),在存在电子供体维生素C(vitamin C,Vc)的情况下,可以氧化裂解纤维素的多糖链,显著提高纤维素的酶解效率.本文克隆了嗜热革节孢Scytalidiumthermophilum AA9家族的一个编码基因pmo7651,并在毕赤酵母GS115进行诱导表达,通过His标签获得了重组蛋白PMO7651-His.以磷酸膨胀纤维素(PASC)为底物进行酶促反应,薄层层析法(TLC)结果显示PMO7651酶解产物主要为纤维二糖至纤维五糖;飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)和溴氧化法确定PMO7651具有C1、C4、C6位的氧化活性;底物结合平面的3个芳香族氨基酸位点突变对酶的活性具有不同程度的影响;在PMO7651帮助下,纤维素酶的降解效率均具有不同程度的提高.

[目的]裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)是一类以氧化方式断裂多聚糖糖苷键的新型木质纤维素降解酶,本文旨在挖掘新型LPMOs并研究其性质.[方法]从米曲霉中克隆LPMO基因,利用毕赤酵母表达系统进行异源表达,研究其酶学性质和还原剂对其活性的影响,进一步探讨LPMO与糖苷水解酶协同作用时的底物结合现象.[结果]AoLPMO2和AoLPMO5序列分析显示,两种蛋白都为辅助酶类9家族的LPMOs;电击转化至真核毕赤酵母GS115中,获得双拷贝转化子GS/AO5-4,经1％甲醇诱导4d后,上清液蛋白表达量为0.19±0.01 g/L.重组蛋白分子量约34 kDa,高于理论分子量,推测可能存在翻译后修饰.酶学性质分析表明,AoLPMO5对刺槐豆胶的最适反应温度和pH分别为60℃和5.0,Km和Vmax分别为8.72±1.99 mg/mL和109.4± 12.8μmol/(s.mg).0.1 mmol/L Cu2+促进酶活性提高(7.1 0±1.32)％(P＜0.05),0.5、2.0和2.5 mmol/L H2O2分别促进酶活性提高(21.11±6.17)％ (P＜0.01)、(20.22±1.13)％ (P＜0.01)和(18.40士2.86)％ (P＜0.01),而没食子酸和维生素C对活性无明显作用.在反应前期,AoLPMO5与刺槐豆胶底物结合从而影响甘露聚糖酶BsMAN3的降解作用.而在反应后期,AoLPMO5与BsMAN3则表现出协同增效作用.[结论]AoLPMO5是一种全新的生物质降解酶,阐明其酶学性质和底物作用方式,将为天然木质纤维素类底物的高效转化与生物炼制,如第二代生物乙醇、功能性低聚寡糖等生产建立基础.

AA9家族的裂解性多糖单加氧酶(lyric polysaccharide monooxygenase,LPMO)广泛存在于真菌中,由于其能作用于木质纤维素的结晶多糖,从而使其在生物转化生物质方面发挥重要的作用.本文首先综述了AA9家族LPMO的结构特点、催化机制、结构与功能之间的关系,其次阐述了AA9家族LPMO的微生物表达与调控,最后简单介绍了AA9家族LPMO在转化木质纤维素中的应用.

[目的]为研究HcLPMO的活性测定方法及其与纤维素酶的协同降解特性.[方法]利用大肠杆菌表达系统进行HcLPMO异源表达,研究以AmplexTM Ultra Red为荧光底物的LPMOs活性检测条件;研究HcLPMO与纤维素酶最优配比协同降解微晶纤维素及其他多种生物质底物的能力.[结果]表达条件确定最适装液量为20％,最适诱导温度为20℃.活性测定研究结果表明HcLPMO需先与铜离子结合才具有活性,电子供体抗坏血酸钠(ASC)最适浓度为10-4mol/L,并发现AmplexTM Ultra Red浓度以及辣根过氧化物酶浓度对酶活的检测影响较小.HcLPMO与纤维素酶协同降解微晶纤维素研究确定HcLPMO与纤维素酶最优配比为2∶3,葡萄糖产量相较纤维素酶单独作用提高了99.48％.此外,针对多种生物质底物,发现该酶与纤维素酶的复配体系对汽爆玉米秸秆和微晶纤维素的协同降解效果较好,相较于单独用纤维素水解酶,葡萄糖产量分别提高了63.81％和59.43％,而对碱处理玉米芯和木薯渣降解效果次之,葡萄糖产量仅分别提高35.41％和11.06％.[结论]HcLPMO与纤维素酶复配能够有效提高酶法降解纤维素效率;而底物前处理如蒸汽爆破或碱处理对于HcLPMO与纤维素酶协同降解木质纤维素影响较大.

[目的]裂解性多糖单加氧酶(LPMO)是一类铜离子依赖型的单加氧酶,能够通过氧化的方式断裂糖苷键,进而显著提高多糖的降解效率,受到广泛的关注.但是LPMO单加氧酶的性质使其容易被自身氧化而失活,且底物的聚合性质和释放产物的多样性使得对LPMO催化过程活性的评估变得十分困难.[方法]本研究以2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)和H12O2为底物,建立了测定几丁质裂解性多糖单加氧酶(BtLPMO 10A)活性的评价体系,并研究该酶在降解几丁质底物过程中的稳定性.[结果]研究发现,在测定BtLPMO10A活性的过程中,较高的酶浓度,过氧化氢浓度和2,6-DMP浓度均使得反应过程脱离了线性范围,而抗坏血酸的加入能够提高灵敏度,但是对活性测定过程有较大影响.BtLPMO10A对2,6-DMP 和 H2O2的Km分别为0.53 mmol/L和5.31 mmol/L,亲和性高于纤维素裂解活性的NcLPMO9C.BtLPMO 10A在还原剂抗坏血酸存在的条件下容易失活,但底物几丁质的加入能够一定程度上稳定LPMO的活性,但是其在降解几丁质过程中活性依然会下降.[结论]本研究以2,6-二甲氧基苯酚为底物检测BtLPMO10A对底物的亲和力,并研究BtLPMO10A的稳定性,为深入评价具有几丁质氧化裂解活性的LPMO的稳定性及其在几丁质降解过程中的应用提供了重要信息.

AA10家族裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)主要分布于细菌中,因其具有催化纤维素和几丁质等结晶多糖氧化降解的特性,在工业生物质转化过程中具有极强的应用潜力,从而受到广泛关注.然而,AA10家族不同LPMOs作用的底物种类及氧化位点和氧化产物也不尽相同,LPMOs的结构与组成对其底物选择性的影响机制有待进一步探究.因此,本文综述了AA10家族LPMOs的模块化结构组成及其催化机制,梳理了AA10家族LPMOs的底物谱,系统总结了AA10家族LPMOs的结构、关键作用残基及多模块组合对底物选择性影响的最新进展,并展望了LPMOs在生物质转化和生物燃料工业中广阔的应用前景.