目的 将二代测序(next generation sequencing,NGS)技术应用至Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)(Sabin strain inactivated poliomyelitis vaccine,sIPV)生产质量监控中,以期确保疫苗的安全性和批间一致性.方法 将脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)Sabin株Ⅰ型、Ⅱ型和Pfizer株Ⅲ型工作种子批分别接种至生物反应器微载体培养的单层Vero细胞上,33 ℃培养3～4d,获得疫苗代次病毒液,每个型别制备3批.提取各型别工作种子批毒种和疫苗代次病毒液RNA,用NGS技术分析基因突变频率、神经毒力决定位点、突变热点及批间一致性.结果 3种型别PV工作种子批毒种经培养后,Sabin株Ⅱ型和Pfizer株Ⅲ型比Sabin株Ⅰ型更易发生突变,非编码区神经毒力决定位点突变频率明显上升(t=3.21～5.83,P均＜0.05),编码区神经毒力决定位点突变频率变化较小(t=1.29～2.34,P均＞0.05)或明显下降(t=6.01～9.62,P均＜0.05);Sabin株Ⅱ型毒株的nt869位点及Pfizer株Ⅲ型毒株的nt2 493位点各发生1个突变热点,突变方式均为C→T,其中nt2493既是神经毒力决定位点,也是突变热点.3种型别各3批疫苗代次病毒液均具有良好的批间一致性,基因组VP1区域各核酸位点突变频率批间拟合R2为0.947～0.995.结论 NGS技术可高效检测sIPV生产过程中PV基因组的突变,且稳定可靠,可用于该疫苗的质量控制.

目的:分析北京市献血人群筛查中发现的1例HIV-1独特型重组毒株的基因结构和重组特点。方法:基于2018年北京市血液筛查时发现的1例HIV核酸阳性抗体阴性的样本，提取病毒RNA并逆转录为cDNA，用近末端稀释法分两段扩增病毒近全长基因组并测定序列。运用RIP、jpHMM和SimPlot3.5软件进行重组分析，同时采用MEGA7软件构建Neighbor-joining系统进化树对该毒株的同源关系进行分析。结果:共获得长度为8 792 bp的HIV-1近全长基因序列，分析表明该序列由CRF01_AE和CRF07_BC重组片段组成。与Los Alamos HIV Database （www.hiv.lanl.gov/content/index）中收录的全长序列相比该毒株具有3个独特的重组断点，分4个重组片段，分别是ICRF01_AE（790~6035，HXB2），IICRF07_BC（6036~8586，HXB2），IIICRF01_AE（8587~8828，HXB2）和IVCRF07_BC（8829~9411，HXB2）。其中ICRF01_AE区域属于CRF01_AE的C4簇；IICRF07_BC区域属于CRF07_BC的CRF07BC_N簇。结论:1例参与献血的HIV核酸阳性而抗体阴性的感染者携带的毒株具有新型独特的重组模式，提示需要加强监测献血人群中HIV毒株的流行情况，为保障安全用血提供科学数据。

虽然目前诊断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的金标准，即实时荧光定量PCR技术已被广泛应用于人群筛查并且检测限可低至1拷贝/μl，但最新的病毒动力学模型表明，相较于灵敏度而言，高频率检测和快速诊断才是减少病毒传播的关键。因此，研究人员正努力探索基于CRISPR-Cas技术的病毒RNA检测新策略。其中，Cas13a蛋白可与CRISPR RNA(crRNA)形成复合物并在crRNA的引导下靶向结合目的RNA序列，激活核酸酶活性，非特异地切割附近的任意单链RNA。利用这一特性，将带有荧光淬灭基团的RNA探针加入体系，可检测靶RNA序列。在此原理上，本研究开发了一种突破性方法，无需前期预扩增即可直接从鼻拭子RNA中检测SARS-CoV-2。通过设计针对病毒N基因和E基因的不同区域的多个crRNA，等浓度组合加入反应体系，使单次反应可以激活更多的Cas13a蛋白，检测灵敏度提高的同时也减少了基因突变导致检测脱靶的可能性，整个检测过程均在样品中直接进行，无需额外操作。此外，该新型检测平台还可以将反应速率和产生的荧光信号转化为病毒载量，样本定性的同时进行RNA定量。为了提高检测的简单性和便携性，本研究还设计了一个小型设备包括低成本的激光照明和光收集元件，可以通过手机摄像头读取CRISPR-Cas13a检测产生的荧光信号，灵敏度达到100拷贝/μl的同时能够在5 min内准确诊断出一组从新型冠状病毒肺炎患者样本中预提取的RNA。本研究开发的方法有可能为现场SARS-CoV-2筛查提供一种快速、准确、便携和低成本的选择。

目的:对从云南重症手足口病患者的粪便样品中分离出的1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4，CV-A4)毒株的全基因组特征和部分区段重组情况进行分析，为深入认识CV-A4的流行和分子进化提供基础数据。方法:分别使用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma，RD)细胞、人胚肺二倍体(human embryonic lung diploid，KMB17)细胞和人非小细胞肺癌(human lung cancer，A549)细胞进行病毒分离。提取病毒RNA，通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)分段扩增CV-A4全长基因，利用MEGA7.0和SimPlot 3.5.1等软件对全基因组及各区段进行分析。结果:从RD细胞上分离到一株CV-A4分离株R11-20/YN/CHN/2011，系统进化分析显示该分离株属于C2基因亚型。在VP1和全基因组核苷酸序列上与其同源性最高的分别是CV-A4毒株09214/SD/CHN/2009和CVA4/SZ/CHN/09。重组分析显示该分离株与肠道病毒A71(enterovirus A71，EV-A71)云南分离株R993/YN/CHN/2010在3D区发生过重组。结论:CV-A4分离株R11-20/YN/CHN/2011为C2基因亚型且与EV-A71在3D区发生重组。

目的:观察骨肉瘤组织和细胞株中环状RNA circ_0000880表达，及其对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:选取经病理确诊的骨肉瘤的标本共16例，采用circRNA高通量测序技术检测表达差异的circRNA。提取骨肉瘤及其癌旁组织总RNA，依据circ_0000880序列，设计divergent primer，扩增包含backsplice junction区域片段，随后连接入pGM-T载体进行测序鉴定。采用SYBR Green荧光定量PCR，分别检测骨肉瘤及其癌旁组织，骨肉瘤细胞MG63、SAOS-2、U2OS及正常人成骨细胞hFOB1.19中circ_0000880的表达水平。将circ_0000880小干扰RNA(siRNA)和circ_0000880 NC慢病毒转染至骨肉瘤细胞后检测细胞中circ_0000880的表达水平，并通过细胞计数试剂盒(CCK-8)及克隆形成实验检测对骨肉瘤细胞增殖的影响。两样本两组间比较用 t检验。 结果:采用circRNA高通量测序技术检测结果显示骨肉瘤组织及细胞中circ_0000880的表达显著上调，并通过测序鉴定证实circ_0000880在骨肉瘤组织中存在、且为环状RNA。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果显示circ_0000880在骨肉瘤组织中的表达量(2.032±0.165)显著高于其癌旁组织(1.105±0.155， t＝16.393， P<0.05)。circ_000088在骨肉瘤细胞系MG63(2.252±0.140)、SAOS-2(2.134±0.176)、U2OS(2.011±0.226)中表达量均显著高于正常人成骨细胞(1.000±0.092， F＝71.299， P<0.05)。转染circ_0000880 siRNA的MG63细胞中circ_0000880表达量明显下降(0.646±0.058)，转染circ_0000880 NC的MG63细胞中circ_0000880表达水平(1.005±0.121)与空白组(1.000±0.201)比较差异无统计学意义( F＝17.977， P<0.05)。CCK-8及克隆形成试验结果显示，与空白组和阴性对照组比较，转染circ_0000880 siRNA的骨肉瘤细胞增殖能力显著受到抑制。 结论:骨肉瘤组织及细胞中circ_0000880表达显著上调，敲低circ_0000880表达可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖能力。

目的:了解吉林省HIV-1（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）感染者治疗前基因型耐药及分子网络传播情况。方法:选取2022年治疗前HIV感染者228名，提取血浆RNA、反转录PCR扩增HIV-1 pol基因片段。建立进化树确定亚型、解析基因型耐药突变（drug resistance mutations，DRMs）情况并构建HIV分子网络评估传播关系。 结果:从228例样本中成功获得206条 pol基因序列，基因亚型主要为CRF01_AE（60.68%，125/206）、CRF07_BC （30.10%，62/206）和B亚型（5.34%，11/206）。总耐药率为9.22%（19/206），耐药突变以非核苷逆转录酶抑制剂为主，占8.25%（17/206）。多因素logistic回归分析表明，40~49岁和≥50岁，离异或丧偶感染人群产生耐药的风险较高（ P<0.05）。白城地区和CRF07_BC感染者入网风险更大（ P<0.05）。有63条序列入网（30.58%，63/206），形成23个分子簇。入网病例中6例携带DRMs。出现本市和跨市连接边关系。异性与同性性传播感染人群存在混合连接边。 结论:吉林省HIV感染者治疗前耐药率处于中等水平，分子网络中的毒株呈地区聚集性，加强耐药监测，对网络桥梁人群进行有针对性的干预措施，减少治疗前发生耐药传播的可能性。

目的:对天津市1例输入基孔肯雅热病例开展病毒基因分型，确定基孔肯雅病毒（CHIKV）与全球主要流行株的关系。方法:提取临床症状疑似为CHIKV感染患者血清中RNA，采用荧光定量RT-PCR法检测CHIKV核酸。两步RT-PCR法扩增编码CHIKV包膜糖蛋白E1的基因，扩增产物经测序后开展测序分析。将测序结果与全球其他地区流行毒株一同构建系统发生树。结果:天津市输入型CHIKV基因分型属于能够感染白纹伊蚊并在其体内繁殖的东/中/南非基因型印度洋亚型（ECSA-IOL）。系统发生树分析表明，此次输入的CHIKV与2016-2017年在巴基斯坦、意大利、孟加拉国等国家流行的CHIKV毒株高度同源，序列的同源性高达99.4%，并与这些国家流行的CHIKV毒株共同组成1个基因分型簇。结论:此次输入性基孔肯雅热病例感染的毒株更容易在人群中传播，提示应加强对基孔肯雅热输入性病例的防控工作，以防止该蚊媒传染病在我国发生本地聚集性传播。

目的:了解南京市新诊断的青年学生人群HIV-1基因亚型及耐药情况，为该人群艾滋病防控工作提供依据。方法:以2015年9月至2019年7月期间南京市新诊断的200例青年学生HIV-1感染者为研究对象，调查其人口学信息，并采集血样。通过RNA提取、PCR扩增，成功获得 pol区片段191条，进一步进行亚型和耐药突变分析。 结果:CRF01_AE (41.4%)和CRF07_BC (30.9%)为主要亚型，其他依次为独特重组型(unique recombinant forms, URFs) (15.7%)、CRF55_01B (5.2%)、CRF68_01B (3.1%)、CRF67_01B (2.6%)和B亚型(1.0%)。耐药突变发生率为16.8%，其中传播性耐药率为4.2%。CRF01_AE、CRF07_BC、CRF55_01B、URFs及其他亚型毒株的传播性耐药比例分别为2.5%、1.7%、10.0%、10.0%和7.7% ( P>0.05)。 结论:青年学生人群中HIV-1重组毒株快速出现，需引起高度重视；传播性耐药临近警戒水平，需要持续监测。

目的:对四川省一例由野生动物(猪獾)咬伤发病的疑似狂犬病病例的唾液标本进行狂犬病病毒的全基因组序列测定，从分子水平对病毒进行遗传变异特征分析，了解四川省野生动物狂犬病病毒的流行和变异情况。方法:从疑似狂犬病病例的唾液标本中提取总病毒RNA，采用PCR的方法以特异性引物进行狂犬病病毒序列扩增，将获得的基因片段进行测序，并运用生物学软件将所得序列进行拼接从而得到狂犬病病毒株的全基因组序列。对全基因组进行遗传变异特征分析。结果:经测序获得1株猪獾源狂犬病病毒(以下简称SCR23-052)全基因组核苷酸序列，经NCBI在线BLAST及与多个参考序列比对表明，SCR23-052全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病毒属特征；分别与宁夏毒株(J)、重庆毒株(CQ92、02050CHI)之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高，SCR23-052基因组序列差异性在氨基酸水平明显低于核苷酸水平，说明蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变。种系发生分析显示SCR23-052属于基因V型，其糖蛋白主要抗原位点未见明显突变，在线网址预测糖蛋白在第56和338位发生了氨基酸糖基化，SCR23-052与参考疫苗株CTN181的信号肽序列相比氨基酸差异最少。本研究病毒在核蛋白主要抗原位点与所有参考疫苗株均发生了相同的突变(332位A→T)，在B细胞表位仅与参考疫苗株CTN181相比发生了379位L→V的突变，SCR23-052与基因Ⅴ型的参考毒株在核蛋白研究位点均一致。结论:获得了1株野生动物猪獾源基因V型狂犬病病毒株全基因组序列，不同于四川以往报道流行的犬源狂犬病病毒基因I型毒株。SCR23-052与各参考株基因组序列相比有不同程度差异，但主要毒力特征未改变。

目的:建立甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)数字芯片式RT-PCR(dRT-PCR)方法并与real time RT-PCR(RT-qPCR)方法进行比较，选出适用于检测草莓中HAV的最佳方法。方法:提取HAV疫苗RNA，优化dRT-PCR的反应条件，评价其特异性；碱性洗脱-PEG浓缩法对草莓标本进行前处理后提取核酸，同时采用dRT-PCR与RT-qPCR方法，检测纯水或草莓基质中HAV疫苗RNA的敏感性、抑制率；比较人工污染草莓中HAV的回收率，并应用于市售标本中的检测。结果:确立了dRT-PCR反应的最适退火温度为60 ℃，最佳引物、探针浓度为0.4 μmol/L、0.4 μmol/L、0.2 μmol/L，特异度良好；两种检测方法检测HAV疫苗RNA在纯水或草莓基质中的敏感性没有明显差异，dRT-PCR的抑制率较低。dRT-PCR与RT-qRCR在检测较高浓度HAV污染草莓标本时的回收率分别为12.90±0.006%、30.12±0.02%；在检测较低浓度HAV污染草莓标本时的回收率分别为18.27±0.07%、10.85±0.03%，差异均具有统计学意义( P<0.05)。对市售标本进行检测，两种方法检测结果均为阴性。 结论:本研究建立的dRT-PCR法，与RT-qPCR检测不同基质中的HAV RNA敏感性没有明显差异，但dRT-PCR对PCR反应抑制物有较好的耐受能力，在检测低浓度HAV时回收率较高。两种检测方法均可用于草莓中甲型肝炎病毒的定量检测，可根据具体实际情况进行选择。