DNA甲基化作为一种表观遗传修饰,在植物的生长、发育和逆境反应中发挥着至关重要的作用.全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing,WGBS)被认为是DNA甲基化研究的"金标准",并且广泛应用于动植物的功能基因组研究.虽然目前针对WGBS已经开发了数种分析工具,但还没有全面评估这些工具在植物基因组中的分析效率.本研究通过分析拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)和大豆(Glycine max)3种主要作物的DNA甲基化数据,对DNA甲基化的 4 个分析工具中常用的 6 种比对方法(BSMAP、Bismark-bwt2-e2e、Bismark-his2、Abismal、BSSeeker2-bwt2-e2e 和 BS-Seeker2-bwt2-local)从运行效率、内存资源利用、比对质量和甲基化位点识别等方面进行了全面的性能评估.结果显示,与另外5种甲基化比对方法相比,虽然BSMAP运存较大,但是在运行速度上表现出较高的效率,尤其在处理大规模基因组数据时具有明显的优势.此外,BSMAP在比对质量和甲基化位点识别方面也展现出较高水平,保证了结果的准确性和可靠性.值得注意的是,研究认为在选择比对工具时,还需要根据实际计算资源、研究需求以及对运行速度和内存消耗的权衡来做出合适的决策.这项研究为从事植物领域DNA甲基化研究的科研人员提供了有益的分析指导,有助于提高研究效率和结果的可信度,对深入分析植物生物学中的DNA甲基化具有重要的科学意义.

AP3/DEF(APETALA3/DEFICIENS)基因为MADS-box基因家族的B类基因,在花发育过程中主要参与调控花瓣和雄蕊发育.对盐肤木(Rhus chinensis)AP3/DEF同源基因进行克隆及功能分析,有助于探究其在盐肤木雄蕊发育过程中的作用.采用RT-PCR技术获得盐肤木AP3/DEF同源基因CDS;利用NCBI CD Search对其序列和结构域进行比较分析;利用酵母双杂交系统,对AP3/DEF同源蛋白与盐肤木中其它MADS-box转录因子进行蛋白互作验证;通过实时荧光定量PCR分析盐肤木AP3/DEF同源基因的时空表达模式;用过表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)验证盐肤木AP3/DEF同源基因在花器官发育中的功能.结果表明,克隆得到2个盐肤木AP3/DEF同源基因分别命名为RcAP3(GenBank:OR962160)和RcTM6(GenBank:OR962159),根据其氨基酸保守结构域比对及系统进化分析,发现这2个蛋白序列与漆树科的芒果(Mangifera indica)和阿月浑子(Pistacia vera)AP3/DEF同源蛋白亲缘关系最近.酵母双杂交结果表明,RcAP3和RcTM6与盐肤木B类蛋白RcPI、C类蛋白RcAG和Rcag存在互作关系,但与A类和E类蛋白不存在互作关系.实时荧光定量PCR分析结果显示,RcAP3和RcTM6基因在不同性别盐肤木花芽快速发育期高表达,在花芽发育早期和开花后表达水平较低;RcAP3在雌花、雄花和两性花的花芽分化过程中均维持较高的表达水平,而RcTM6在两性花中显著表达,在雄花和雌花中表达量很低.两性花快速生长期,RcAP3在花瓣和雄蕊中高表达且差异很小,而RcTM6在雄蕊中的表达量显著高于其它花器官.RcAP3基因能恢复拟南芥ap3-3突变体花瓣和雄蕊的缺陷表型,RcTM6过表达则导致拟南芥花瓣、雄蕊和子房缩短,花药败育,表明盐肤木中同属AP3/DEF亚家族的同源基因RcAP3和RcTM6存在功能分化.RcAP3促进花瓣和雄蕊发育,而RcTM6抑制雄蕊发育.研究结果为进一步研究盐肤木性别分化的分子机制奠定了基础.

Trihelix转录因子的功能使其在许多非生物逆境胁迫中都具有重要作用,尤其表现为参与低温、干旱、洪涝、盐碱、脱落酸、茉莉酸甲酯等众多非生物胁迫的信号途径.然而目前对人参Trihelix基因家族的研究还较少.该研究从人参基因组数据库中鉴定筛选出41个Trihelix基因家族成员,使用生物信息学方法分析家族成员理化性质、顺式作用元件、亚细胞定位、染色体定位与非生物胁迫诱导的表达模式.结果表明人参Trihelix家族成员85％定位于细胞核中,Trihelix蛋白二级结构以无规则卷曲和a螺旋为主.在Trihelix的启动子区域鉴定出了与低温、激素响应、生长发育等多种非生物胁迫相关的顺式作用调节元件.通过对模式植物拟南芥和人参进行种间的Trihelix转录因子共线性分析发现人参与拟南芥之间共有共线性基因对19个,仅3、6、12号染色体不存在共线性基因对.qRT-PCR分析结果表明基因GWHGBEIJ010320.1在低温胁迫下表达量显著上调,显著响应低温胁迫.该研究为今后探讨人参Trihelix转录因子在人参非生物胁迫以及人参生长发育过程中的功能奠定了基础.

目的:优化芥子微波和恒温鼓风烘烤炮制工艺.方法:建立白芥子苷含量测定方法;按照析因设计试验法,通过CRITIC法计算外观性状、芥子碱硫氰酸盐和白芥子苷3个指标的权重系数,以综合评分为指标,考察微波火力、恒温鼓风烘烤温度、加热时间对炮制品的影响,选出2种炮制工艺的最佳炮制品;通过噻唑蓝(MTT)比色法考察最佳炮制品与传统文火清炒炮制品对HaCaT细胞活力的影响.结果:芥子微波大火加热2 min、150℃恒温鼓风烘烤30 min得到的炒芥子综合评分最高,芥子碱硫氰酸盐含量符合2020年版《中华人民共和国药典》要求;与传统炮制品比较,白芥子苷含量更高,在800μg/mL浓度时对HaCaT细胞均无明显毒性.结论:微波、恒温鼓风烘烤芥子炮制工艺合理、可行、易操作,可为炒芥子的规范化生产提供参考依据.

蒙古冰草(即沙芦草(Agropyron mongolicum))是我国北方代表性的多年生牧草之一,具有较强的耐寒和耐旱能力.在植物中,咖啡酸氧甲基转移酶基因(COMT)是参与木质素和褪黑素生物合成的关键基因,在调节植物生长、品质和抗逆性中发挥重要作用.通过分析蒙古冰草全长转录组数据,从蒙古冰草中克隆了COMT候选基因AmCOMT1.该基因在茎秆和根等木质素含量高的组织中高表达,且其表达受多种非生物胁迫诱导.在拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型(Col-0)和突变体(omt1-2)中过表达AmCOMT1,显著促进了转基因拟南芥的木质素合成,使突变体的木质素单体和组分恢复至野生型水平,同时Col-0135S:AmCOMT1中木质素总量提高11％.此外,AmCOMT1过表达显著提高了Col-0/35S:AmCOMT1转基因拟南芥的褪黑素含量.在盐胁迫条件下,该株系平均根长相比野生型拟南芥提高20.3％,表现出更强的抗逆性.综上,蒙古冰草AmCOMT1基因在木质素和褪黑素合成中发挥关键作用,可提高转基因拟南芥的抗逆性,在蒙古冰草等单子叶牧草遗传改良方面具有重要应用潜力.

[目的]bHLH转录因子广泛存在于植物中,是调控植物生长发育和响应逆境胁迫的重要转录因子家族之一.从金钗石斛全基因组中鉴定DnbHLHs转录因子家族,分析其表达特点,为后续深入研究DnbHLHs转录因子的生物学功能奠定基础.[方法]利用生物信息学方法从金钗石斛全基因组中鉴定出bHLH转录因子家族成员,并对其理化特征、系统进化关系、基因结构、染色体定位和启动子顺式作用元件等进行分析,利用转录组数据和RT-qPCR分析DnbHLHs转录因子的组织表达模式和不同非生物胁迫下的表达规律.[结果]在金钗石斛中共鉴定出 137 个bHLH转录因子,DnbHLHs蛋白的氨基酸数量为 85-1 260,分子量为 9 855.23-140 024.19 Da,等电点为 4.52-10.66,不稳定系数为 31.94-87.42,脂溶指数为 56.66-106.06,亲水指数为-0.815-0.185.DnbHLHs分布于金钗石斛的 19 条染色体上,都存在bHLH结构域,与拟南芥的bHLH同源,且组内、种间存在着共线性关系.基因表达模式分析显示,DnbHLHs家族成员存在组织表达特异性,且DnbHLH26 和DnbHLH33 对多种逆境胁迫有响应.[结论]从金钗石斛全基因组中鉴定出 137 个DnbHLHs转录因子家族成员,该家族成员的理化性质和保守基序存在特异性和多样性的特征,不同DnbHLHs转录因子之间具有组织表达差异性,且DnbHLH26 主要受高盐和高温胁迫的诱导,DnbHLH33 主要受高盐、高温和低温胁迫的诱导.

芥子碱是一种广泛存在于十字花科植物中的季铵盐型生物碱,具有多种生物活性.芥子碱可通过抑制肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭,逆转肿瘤细胞多药耐药发挥抗肿瘤作用;通过抑制RAAS的活化及改善血管内皮功能障碍发挥心血管保护作用;通过松弛支气管平滑肌、降低炎症因子水平治疗呼吸系统疾病.鉴于芥子碱在肿瘤、心血管系统疾病及呼吸系统疾病治疗中的良好的效果,其具有被开发为多种疾病治疗药物的潜力.

[目的]AtiPGAM2 基因是拟南芥(Arabidopsis thaliana)碱性磷酸酶超家族的成员,参与糖酵解过程.研究AtiPGAM2 基因在逆境胁迫下的响应机制,为进一步研究AtiPGAM2 的抗逆功能奠定基础.[方法]使用PlantCARE在线软件对AtiPGAM2 基因启动子顺式作用元件进行分析.采用实时荧光定量PCR,检测AtiPGAM2 在NaCl和ABA胁迫下的响应模式.克隆AtiPGAM2 基因转入拟南芥,获得AtiPGAM2 基因超表达株系.利用三引物法鉴定Atipgam2 突变体.对过表达、突变体和野生型在盐胁迫下的萌发率、绿苗率以及各种非生物胁迫(甘露醇、ABA和MeJA)下的表型,进行统计分析.[结果]其启动子上存在多个光、MeJA、低温、ABA、SA、GAs等非生物胁迫和激素响应元件.荧光定量PCR分析显示,AtiPGAM2 在NaCl和ABA胁迫下受到不同程度的诱导.成功获得AtiPGAM2 基因过表达和突变体株系.在盐胁迫条件下AtiPGAM2 过表达株系萌发率以及绿苗率均高于野生型,突变体表型则相反.甘露醇处理下突变体的萌发率低于野生型.ABA处理 48 h内突变体和过表达AtiPGAM2 株系的萌发率都低于野生型.MeJA处理下过表达的侧根数量高于野生型,突变体则相反.[结论]AtiPGAM2具有耐盐性,该基因响应甘露醇、ABA和MeJA处理.

目的:研究远志中寡糖酯类成分 3,6?-二芥子酰基蔗糖(DISS)对神经的保护作用.方法:将不同浓度的DISS与APP-SH-SY5Y细胞共同孵育 24 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞的存活率,免疫荧光法检测细胞内活性氧(ROS)水平,生化法检测超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,ELISA法检测细胞内和培养液中β-淀粉样蛋白(Aβ)含量,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞内淀粉样前体蛋白(APP)、微管相关蛋白轻链 3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)和LC3-Ⅱ的表达.结果:DISS可以提高APP-SH-SY5Y细胞的存活率(P<0.05),减少细胞内ROS的生成(P<0.01),提高SOD和GSH-Px活力(P<0.05),降低细胞内和培养液中的Aβ含量(P<0.01,P<0.05),明显升高细胞内LC3Ⅱ蛋白表达水平,升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平(P<0.05),对APP表达无明显影响.结论:DISS可能通过降低细胞内氧化应激,减少细胞Aβ表达及调节自噬发挥神经保护作用.

[目的]VQ蛋白是一类含有保守VQ基序(FxxhVQxhTG)的植物特异性蛋白,在植物生长发育和非生物胁迫应答中发挥重要作用.研究鉴定了荔枝VQ基因家族,并分析其在不同组织的表达模式及在低温、高温、干旱和盐胁迫下的应答,为后续研究其抗逆机制奠定了基础.[方法]用生物信息学方法在荔枝全基因组中鉴定LcVQ基因,并对其理化性质、亚细胞定位、基因结构和保守基序等进行分析;用MEGA 6.0软件构建系统发育树,分析荔枝、拟南芥和水稻VQ蛋白的系统发育关系;用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证LcVQs对多种非生物胁迫的响应情况.[结果]荔枝中共鉴定获得可聚类为9个亚族的18个VQ基因(LcVQ1-18),依次分布在荔枝的11条染色体上,其编码蛋白的氨基酸数介于111～427之间,分子质量为12.48～45.49 kD;除LcVQ15和LcVQ17定位于细胞质之外,其余LcVQ蛋白均定位于细胞核.LcVQs启动子区域包含大量植物生长发育响应元件、激素响应元件及逆境响应元件.LcVQs的表达量在不同组织中具有明显差异,总体上分为普遍性表达和特异性表达.LcVQs可快速响应非生物胁迫,在低温、高温、干旱和盐胁迫处理3 h内分别有4,3,3,4个LcVQs明显上调表达.[结论]荔枝全基因组中有18个VQ家族成员,具有典型VQ保守结构域,能差异化响应多种非生物胁迫.