目的:探讨环状RanGTP酶激活蛋白1（circular RanGTPase activating protein 1，circRANGAP1）在子痫前期中对滋养细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制。方法:收集2020年8月至2022年12月于中国医科大学附属盛京医院就诊的子痫前期患者及年龄、孕周匹配的对照组产妇的胎盘组织（早发子痫前期组和早发对照组各8例，晚发子痫前期和晚发对照组各24例），采用实时荧光定量法检测胎盘组织中circRANGAP1及人真核翻译起始因子4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3，EIF4A3）mRNA表达水平，蛋白质印迹法检测EIF4A3蛋白表达水平。取滋养细胞系HTR-8/Svneo，采用细胞计数增殖试验、划痕试验和Transwell侵袭试验检测增殖、迁移和侵袭能力，采用RNA结合蛋白免疫沉淀法检测EIF4A3对circRANGAP1的调控作用。敲降EIF4A3表达后，实时荧光定量聚合酶链反应法检测HTR-8/Svneo细胞中circRANGAP1的变化。采用独立样本 t检验、非参数 χ2检验或Pearson相关分析对数据进行统计学分析。 结果:（1）早发子痫前期中circRANGAP1表达与早发对照组差异无统计学意义，晚发子痫前期中circRANGAP1表达高于晚发对照组（3.764±3.297与0.960±0.720， t=4.07， P<0.001）。在晚发子痫前期中，circRANGAP1的表达与收缩压及舒张压均呈正相关（收缩压： r=0.639， P<0.01；舒张压： r=0.800， P<0.001）。早发子痫前期中EIF4A3 mRNA及蛋白质表达与早发对照组差异无统计学意义，晚发子痫前期中EIF4A3 mRNA及蛋白质表达高于晚发对照组（mRNA：2.963±3.081与1.149±0.667， t=2.30， P=0.028；蛋白质：2.504±1.008与0.258±0.180， t=4.39， P=0.005）。（2）小干扰（small interfering，siRNA）敲降后，mRANGAP1的表达量差异无统计学意义，而circRANGAP1的表达量降低（1.000±0.004、0.465±0.031与0.621±0.030），其中si-1敲降效率最高（ t=23.59， P=0.002）。特异性敲降circRANGAP1后，滋养细胞的增殖（1.297±0.058与1.456±0.030， t=－5.97， P<0.001）、侵袭（94.400±6.504与219.000±19.870， t=－13.32， P<0.001）和迁移［（25.493±3.498）%与（58.456±3.277）%， t=－15.38， P<0.001］能力均升高。（3）EIF4A3在circRANGAP1 pre-mRNA上游区域存在6个结合位点。EIF4A3可以通过区域a和区域b结合，但不能通过区域c结合。siRNA敲降后，EIF4A3的表达量降低（1.003±0.101、0.276±0.060、0.398±0.074与0.184±0.017），其中si-3敲降效率最高。敲降EIF4A3后，滋养细胞中circRANGAP1表达下降（1.004±0.118与0.480±0.039， t=5.96， P=0.027）。 结论:circRANGAP1在EIF4A3的调控下抑制滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力，参与子痫前期发病。

探讨人参皂苷Rg,(GRg1)对脓毒症急性肺损伤(SALI)的干预疗效与作用机制.采用盲肠结扎穿孔术(CLP)建立SALI小鼠模型,随机分组给予GRg1干预,记录存活与体质量变化情况,小鼠无创肺功能检测系统检测肺功能,苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织损伤情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测炎症因子含量与表达,流式细胞术、TUNEL染色等检测凋亡情况,蛋白质印迹(Western blot)、qRT-PCR检测凋亡相关分子胱天蛋白酶3(caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)与内质网应激相关分子蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核翻译起始因子2α激酶(eIF2α)、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)的活化表达情况.此外,利用脂多糖(LPS)体外诱导小鼠肺泡上皮细胞损伤模型,给予内质网应激激动剂衣霉素(TUN)验证GRg1的作用机制.结果显示,与模型组相比,GRg1干预可提高CLP小鼠生存时间,减缓其体质量下降,改善其受损的肺功能指标.同时,与模型组相比,GRg1给药组小鼠肺组织病理损伤评分降低,肺组织湿干比和肺泡灌洗液蛋白含量降低,血清白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及肺组织中上述细胞因子的mRNA表达下降,肺泡上皮细胞凋亡比例明显下降,caspase-3、Bax表达下调,Bcl-2表达上调,PERK、eIF2α、ATF4、CHOP活化及表达下调.体外结果显示联合TUN后,GRg1降低凋亡细胞比例、下调凋亡相关蛋白表达的作用被抑制.综上,GRg1可减少肺泡上皮细胞凋亡,抑制肺部炎症渗出,减轻肺损伤,改善肺功能,可能与PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路相关.

目的:通过生物信息学技术比较哮喘患者与健康人的基因芯片数据,初步鉴定与哮喘相关的基因以及治疗哮喘的潜在药物.方法:从基因表达数据库下载GSE74986基因芯片,使用GE02R分析得出差异表达基因,采用Morpheus制作差异表达基因的热图;通过DAVID 6.8对差异表达基因进行基因本体及京都基因与基因组百科全书分析,使用String 10.5构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,筛选核心基因.进一步使用Cytoscape 3.6.1的插件MCODE对差异表达基因进行模块分析.通过医学本体信息检索平台筛选治疗哮喘的小分子药物.结果:筛选出510个差异表达基因,包括29个上调基因和481个下调基因.差异表达基因生物过程与通路主要富集在染色质沉默、核糖核酸聚合酶Ⅱ启动子的转录调节、蛋白质转运、信使核糖核酸加工、核糖核酸剪接以及泛素介导的蛋白水解、内质网中的蛋白质加工、核糖核酸转运、髓样分化因子依赖性Toll样受体信号通路、血小板激活、核苷酸结合寡聚化结构域样受体信号通路等.共得出9个核心基因,包括T-复合蛋白1θ亚基(CCT8),T复合物蛋白1α亚单位(TCP1),26S蛋白酶调节亚单位S10B(PSMC6),热休克蛋白90α(HSP90A) A1,细胞周期蛋白C(CCNC),HSP90AB1,26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基6(PSMD6),泛素特异性蛋白酶14(USP14),真核细胞翻译起始因子4E(EIF4E).得出2个重要模块,模块里的基因主要涉及剪接体和泛素介导的蛋白水解、蛋白修饰以及核糖核酸修饰等生物过程.治疗哮喘的潜在小分子药物有茴香霉素和金雀异黄素等.结论:差异表达基因和核心基因促进了对哮喘发病分子机制的理解,为哮喘的诊治提供了潜在的基因靶标与治疗药物.

目的:探讨C-myc是否参与肝肿瘤HepG2细胞内蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)对第10号染色体同源丢失性磷酸酶基因和张力蛋白(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)表达的调控.方法:HepG2细胞经不同浓度的AKT抑制剂Capivasertib(5、10及20nmol/L)处理后,采用蛋白质印迹法检测AKT、C-myc和Bad及其磷酸化蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR法检测对C-myc下游真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF-4E)、支链氨基酸氨基转移酶1(branched-chain amino acid aminotransferase 1,BCAT1)及WW结构域E3泛素连接酶1(WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1,WWP1)基因转录活性的影响.采用siRNA法沉默HepG2细胞中eIF-4E、BCAT1及WWP1基因的表达,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测沉默eIF-4E、BCAT1及WWP1基因表达对PTEN转录和蛋白表达水平的影响;细胞荧光免疫法检测Capivasertib或沉默WWP1基因表达对PTEN在HepG-2细胞中表达和定位的影响.结果:HepG2细胞经不同浓度的Capivasertib处理8h后,磷酸化-AKT(phospho-AKT,p-AKT)、p-C-myc和p-Bad蛋白的表达水平均较对照组明显下调(P值均＜ 0.01),C-myc调控的下游基因eIF-4E、BCAT1及WWP1 mRNA的表达水平均明显下调(P值均＜0.01).沉默eIF-4E、BCAT1及WWP1基因表达,对PTEN mRNA的表达均没有明显影响(P值均＞ 0.05),但沉默WWP1基因表达可使PTEN蛋白的表达水平明显上调(P＜0.01).细胞荧光免疫实验进一步证实,沉默WWP1基因表达与Capivasertib作用均可增强PTEN在HepG2细胞中的表达水平并使其在细胞膜上聚集.结论:AKT能通过C-myc信号途径影响WWP1基因的转录水平,进而实现对HepG2细胞中PTEN表达的调控.

目的 探讨Myriocin对高脂饮食诱导的整合应激反应的影响及作用机制.方法 18只ApoE-/-小鼠随机分为高脂饮食+磷酸盐缓冲液(对照组,9只)或高脂饮食+磷酸盐缓冲液+ Myriocin (Myriocin组,9只)两组,12周后测定血清脂质[总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇],流式细胞术测定淋巴细胞抗原6复合体(Ly-6c)high亚型单核细胞比例,HE染色测定主动脉窦斑块和脂质坏死核相对面积,免疫荧光染色观察单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定炎症反应相关分子[炎性因子白细胞介素-1β和6(IL-1β和IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和抗炎性因子IL-10]和整合应激反应相关分子[葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、活化转录激活因子4和6(ATF4和ATF6)、内质网应激相关促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)和Caspase12] mRNA表达,Western blotting法测定整合应激反应相关蛋白[eIF2α、ATF4、肌醇依赖酶1α(IRE1α)和磷酸化IRE1α、p65核因子-κB(NF-κB)和磷酸化p65 NF-κB、Caspase 12和活化型Caspase 12]表达水平.结果 (1)经Myriocin灌胃12周后,小鼠血清LDL-C水平降低(t=2.830,P=0.012).(2)流式细胞术分析,经Myriocin灌胃8周后,小鼠Ly-6chigh亚群单核细胞比例下降(t=2.866,P=0.011).(3)HE染色观察,Myriocin组小鼠斑块面积小于对照组,在距主动脉瓣200和300 μm处,Myriocin组斑块面积小于对照组(t=2.281,P=0.045;t=3.506,P=0.003),Myriocin组小鼠脂质坏死核相对面积亦小于对照组(Z=-2.870,P=0.004).(4)免疫荧光染色观察,Myriocin组小鼠MCP-1水平低于对照组.实时荧光定量PCR显示,Myriocin组小鼠IL-1β mRNA(t=3.968,P=0.005)、TNF-α mRNA(t=7.696,P=0.000)、ICAM-1 mRNA(t=3.294,P=0.013)、VCAM-1 mRNA(t=5.449,P=0.001)和VEGF mRNA(t=2.574,P=0.037)表达均降低,IL-10mRNA升高(t=-3.132,P=0.017).(5)实时荧光定量PCR显示,Myriocin组小鼠PERK mRNA(t=4.174,P=0.004)、eIF2α mRNA(Z=-2.692,P=0.007)、ATF4 mRNA(t=3.342,P=0.012)、ATF6 mRNA(t=5.841,P=0.001)和Caspase12 mRNA(t=7.270,P=0.000)表达降低.(6)Western blotting检测,Myriocin组小鼠eIF2α(t=2.175,P=0.047)、ATF4(t=2.923,P=0.011)和磷酸化p65 NF-κB/总p65 NF-κB比值(t=2.909,P=0.011)下降.结论 鞘脂抑制剂Myriocin可以抑制高脂饮食诱导的整合应激反应和炎症反应,延缓ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化进展.

目的:探讨内质网应激(ERS)及内质网自噬对移植黑色素瘤模型淀粉样蛋白前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)小鼠移植瘤生长的抑制作用,并阐明蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-真核翻译起始因子2α(eIF2α)-活化转录因子4(ATF4)通路在其抑制作用中的可能机制.方法:体外培养B16细胞,通过皮下注射分别植入C57和APP/PS1小鼠背部皮下,建立C57BL/6J和APP/PS1雄性小鼠移植黑色素瘤模型,作为C57移植瘤组(n=7)和APP/PS1移植瘤组(n=7).观察2组小鼠出瘤时间并计算肿瘤体积,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组小鼠移植瘤组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、PERK和溶酶体组织蛋白酶L(cathepsin L)mRNA表达水平,Western blotting法检测2组小鼠移植瘤组织中GRP78、PERK、磷酸化PERK(p-PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、活化转录因子4(ATF4)和内质网自噬标志蛋白FAM134B蛋白表达水平,免疫组织化学法检测移植瘤组织中蛋白质二硫异构酶(PDI)蛋白表达情况,免疫荧光法测定2组小鼠移植瘤组织中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平.结果:与C57移植瘤组比较,APP/PS1移植瘤组小鼠出瘤时间晚,肿瘤体积小(P<0.05),移植瘤组织中ERS相关基因GRP78和PERK mRNA表达水平升高(P<0.05),移植瘤组织中GRP78、p-eIF2α/eIF2α和ATF4蛋白表达水平及p-PERK/PERK比值均升高(P<0.05).C57移植瘤组肿瘤细胞胞质内多见黑色素颗粒,为移植瘤组织的形态特征,可见少量棕黄色颗粒,为PDI阳性颗粒;APP/PS1移植瘤组肿瘤细胞胞质内可见少量黑色素颗粒和广泛表达的棕黄色颗粒.与C57移植瘤组比较,APP/PS1移植瘤组小鼠移植瘤组织中内质网自噬标志蛋白FAM 134B蛋白表达水平升高(P<0.05),cathepsin L mRNA表达水平升高(P<0.05),ATP水平降低(P<0.05).结论:APP/PS1移植瘤模型小鼠肿瘤生长缓慢,其机制可能与ERS的PERK-eIF2α-ATF4信号通路被激活有关.

白质消融性白质脑病(leukoencephalopathy with vanishing white matter,VWM)是一种常染色体隐性遗传性脑白质病,其致病基因EIF2B1～5分别编码真核细胞蛋白质翻译起始因子2B(eukaryotic initiation factor 2B,eIF2B)的5个亚基α～ε,其中任一编码基因突变均可引起发病.起病多见于婴幼儿及儿童期,临床表型差异大,典型表现为进行性运动功能退行,可伴共济失调和癫痫.应激(发热、外伤等)可导致发作性加重.影像学显示大脑白质进行性液化.尸解神经病理学特征主要表现为广泛性白质稀疏和囊性变性,无神经胶质细胞反应性增生,星形胶质细胞形态异常,过表达祖细胞标志物巢蛋白(Nestin)和胶质纤维酸性蛋白δ(GFAPδ),少突前体细胞数量增加和成熟少突胶质细胞减少、泡沫化且凋亡增加.VWM致病基因EIF2B1～5是管家基因,但多数患者通常仅脑白质受累.少数胎儿期及婴儿早期发病的患者可出现多系统受累,成年女性患者可有卵巢功能障碍.目前认为,星形胶质细胞在其致病机制中起着核心作用,病理性星形胶质细胞继发性引起少突胶质细胞成熟障碍和髓鞘形成异常,进而导致脑白质病变.其他疾病机制包括内质网应激后未折叠蛋白反应(UPR)过度激活、线粒体功能障碍、自噬抑制等,尚不完全明确.

目的:探究长期抗阻训练通过调控细胞焦亡途径而影响骨骼肌蛋白质代谢的可能机制.方法:30只8月龄SD大鼠分为3组:基础值组(N组,n=10),干预前取材;安静对照组(C组,n=10),正常饮食32周,不运动;抗阻训练组(R组,n=10),进行30％负重(自身体重)、35°坡度、跑速15 m/min的跑台训练,每次训练4组×2个循环,隔天训练一次,共32周.干预后测试大鼠体重、瘦体重、胫骨前肌(TA)湿重;HE染色观察肌纤维形态并计算肌纤维横截面积;Western blot测试肌肉合成相关蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1),分解相关蛋白叉头状转录因子O1(FoxO1)、肌肉环状指基因1(MuRF1)、肌肉萎缩盒F基因(Atrogin1)和泛素(Ub)的表达;细胞焦亡PCR芯片筛选TA中的焦亡差异表达基因,qPCR验证芯片结果准确性;WesternBlot测试细胞焦亡关键蛋白核因子-κB(NF-κB)、接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、消皮素D(GSDMD)和天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase1/Casp1)的表达.结果:(1)C组大鼠体重显著高于N组,R组显著低于C组;C组瘦体重及其百分含量显著低于N组,R组显著高于C组(P<0.05).(2)C组肌纤维横截面积较N组显著降低,R组较C组显著增加(P<0.05).(3)C组磷酸化4E-BP1(p-4E-BP1)蛋白含量和p-4E-BP1/4E-BP1比值显著低于N组,R组p-4E-BP1蛋白含量显著高于C组(P<0.05);C组FoxO1和Ub蛋白含量显著高于N组,R组显著低于C组,C组p-FoxO1/FoxO1比值显著低于N组,R组显著高于C组(P<0.05).(4)焦亡PCR芯片结果显示,R组较C组下调的焦亡基因数目增加.对C/N组上调的差异基因Asc,C/N组上调且在R/C组下调的差异基因核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族凋亡抑制蛋白6(Naip6)和R/C组下调的差异基因Casp1进行qPCR验证,与芯片结果一致.(5)C组NF-κB和ASC蛋白含量显著高于N组,R组Caspase1蛋白含量显著低于N组(P<0.05).结论:长期抗阻训练通过降低骨骼肌蛋白质分解而缓解增龄性肌萎缩的发展,抑制细胞焦亡可能是其机制之一.