探讨高毒力肺炎克雷伯菌（Hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HvKP）生物被膜形成能力及耐药性，为HvKP感染治疗提供科学依据。回顾性收集2021年1至12月长沙市中心医院临床感染标本所分离的非重复肺炎克雷伯菌96株，同时收集患者临床资料。黏液拉丝试验初步区分HvKP和普通肺炎克雷伯菌（Classic Klebsiella pneumoniae，CKP），微孔板法测定肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）临床菌株的生物被膜形成能力，Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统进行细菌鉴定及药敏试验，比较分析HvKP组患者和CKP组患者临床资料、菌株生物被膜形成能力以及耐药性。结果显示，96株非重复KP中共分离出20株HvKP，检出率为20.8%，HvKP中呼吸道标本占比最高，达75.0%。HvKP感染患者肝胆疾病患病率以及多部位感染率高于CKP感染患者，差异具有统计学意义（ χ2=5.184、7.488， P=0.023、0.006）。两组患者从性别、年龄、是否入住ICU、高血压、糖尿病、冠心病、肺部疾病、泌尿系统疾病、中枢神经系统疾病、实验室检测指标比较，差异无统计学意义（ P均>0.05）。HvKP中有17株（85.0%）能形成生物被膜，其中弱成膜2株（10.0%）、中等成膜10株（50.0%）、强成膜5株（25.0%）；而76株CKP有71株（93.4%）能形成生物被膜，其中弱成膜13株（17.1%）、中等成膜30株（39.5%）、强成膜28株（36.8%），HvKP生物被膜形成率与CKP比较，差异无统计学意义（ χ2=1.470， P=0.225）。HvKP整体耐药率不高，但发现1株耐碳青霉烯类抗生素的多重耐药HvKP，多重耐药HvKP检出率（5.0%）低于多重耐药CKP（28.9%），差异具有统计学意义（ χ2=4.984， P=0.026）。HvKP对哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、头孢比肟、妥布霉素、米诺环素、多西环素、复方磺胺甲噁唑的耐药率低于CKP，差异具有统计学意义（ P均<0.05）。综上，本研究高毒力肺炎克雷伯菌大多能够形成生物被膜，但与普通肺炎克雷伯菌比较成膜能力差异不明显，HvKP对常用抗菌药物保持较高的敏感性，但不能忽视该菌的耐药性监测。

目的:构建乙脑/寨卡嵌合病毒(ChimZIKV)并评价其是否可成为寨卡候选疫苗株。方法:用基因克隆技术将寨卡病毒prM/E基因替换乙脑病毒疫苗株相应区域，构建乙脑寨卡嵌合病毒感染性克隆，体外转录制备RNA，电转染导入BHK-21细胞拯救获得ChimZIKV，通过噬斑试验、免疫荧光、基因测序鉴定病毒；检测其生长特性；通过动物实验分别检测其小鼠脑内神经毒力、病毒血症、中和抗体产生能力及免疫保护效果。结果:酶切和测序结果表明ChimZIKV感染性克隆成功构建，病毒测序及免疫荧光证实嵌合病毒拯救成功；噬斑试验显示该嵌合病毒呈小噬斑；生长曲线显示其增殖速度慢于乙脑疫苗株；细胞增殖活性试验显示该嵌合病毒感染组细胞的增殖活性明显高于乙脑病毒疫苗株感染组；动物实验结果显示嵌合病毒对小鼠和乳鼠都表现出极低的神经毒力；病毒血症结果显示该嵌合病毒在小鼠体内没有检测到明显的病毒血症；噬斑减少中和试验显示免疫小鼠血清中和抗体的阳转率达100%，第3周中和抗体效价最高(GMT＝85)；免疫保护试验显示对ChimZIKV(MR766)的脑内攻击保护率为30%。结论:嵌合病毒ChimZIKV具有一定的免疫原性和较好的安全性，有进一步发展为寨卡病毒候选疫苗株的可能。

目的:对新疆乌鲁木齐市活禽市场家禽中分离的H5N8亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)进行遗传进化和分子特征分析。方法:2016年于乌鲁木齐市某活禽市场采集家禽咽和泄殖腔拭子，经接种鸡胚、血凝试验和RT-PCR等方法分离鉴定AIV，以AIV通用引物扩增病毒基因并进行全基因组测序，利用BLAST、Clustal W、MEGA-X和DNAStar等软件进行序列比对、系统进化和分子特征分析。结果:从家禽双腔拭子样品分离到5株H5N8 AIVs，其各基因的一致性在99.70%~100.00%之间，说明5株病毒为同一来源，统一命名为XJ-H5N8/2016。系统进化分析表明，该病毒株血凝素基因( HA)、 PB2和 NS均与2016—2017年湖北、山西和三门峡等地迁徙天鹅以及印度水鸭中分离的H5N8 AIVs聚在一起，同时，3个基因还与国内水貂中分离的H5N6 AIVs以及福建首例人感染H5N6 AIVs聚在一起；神经氨酸酶基因( NA)与2016年印度水鸭中分离的H5N8 AIVs聚在同一终末分支； PB1、 MP、 PA和 NP均与2017年自埃及、喀麦隆、乌干达、刚果等非洲国家野鸟和家禽中分离的H5N8 AIVs聚在一起。XJ-H5N8/2016的HA裂解位点均含5个连续的碱性氨基酸，为高致病性，病毒基因发生的多个突变可增强病毒对哺乳动物的毒力和致病力。 结论:从活禽市场分离的5株H5N8 AIVs呈高致病性，与2016—2017年湖北、山西、三门峡等地区以及非洲和印度等地迁徙候鸟和家禽中分离的H5N8 AIVs进化关系密切，部分基因还与国内水貂中分离以及感染人的H5N6 AIVs的遗传关系较近，其多个突变可增强AIV对哺乳动物的感染力和致病力，潜在感染人类和威胁公共卫生安全的风险。

目的:探讨河南省某医院高毒力耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（hv-CRKP）的临床分布、耐药特征和分子流行病学特征，为临床治疗用药和院内感染防控提供科学依据。方法:采用临床资料回顾性研究。回顾性分析2020年1月至2022年12月河南省中医院临床微生物实验室分离的CRKP菌株相关患者的临床资料。利用挑丝试验、毒力基因检测、血清杀伤试验和大蜡螟幼虫毒力试验联合检测筛选出hv-CRKP菌株；WHONET 5.6分析hv-CRKP临床特征及25种抗菌药物耐药率；胶体金法检测hv-CRKP的碳青霉烯酶表型，多聚酶链式反应（PCR）技术和桑格测序技术检测hv-CRKP检测碳青霉烯酶耐药基因、多位点序列分型（MLST）和荚膜血清型。结果:2020—2022年本院共检出非重复CRKP临床分离株264株，其中hv-CRKP 23株，hv-CRKP的检出率为8.71%（23/264），主要分布在重症医学科（10/23）和神经外科（8/23），标本来源主要为痰液（10/23）和支气管肺泡灌洗液（6/23）；hv-CRKP对β-内酰胺类、氟喹诺酮类和氨基糖甙类抗菌药物高度耐药，仅对多黏菌素B、替加环素和头孢他啶/阿维巴坦保持较好的敏感性；23株hv-CRKP中KPC-2型碳青霉烯酶的检出率为91.30%（21/23），未检出B类和D类碳青霉烯酶；MLST和荚膜血清分型结果显示，本院hv-CRKP主要为ST11型，占比56.52%（13/23），荚膜血清型以K64（9/13）和KL47（4/13）为主。结论:hv-CRKP主要来自重症科室的下呼吸道标本，耐药情况较为严重，流行株具有一定的多态性，主要为产KPC-2型碳青霉烯酶的ST11-K64型和ST11-KL47型。

目的 探讨脊髓灰质炎疫苗猴体神经毒力试验毒力返强对神经免疫反应的影响及病理机制.方法 Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)的原液(≥7000 lgCCID50/L)以及10-1稀释各型脊髓灰质炎疫苗采用脑内法进行神经毒力试验,观察脊髓灰质炎的病理变化,并利用免疫组织化学法检测脊髓灰质炎病毒受体CD155以及CD4+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞和CD68+小胶质细胞的分布.结果 发生脊髓灰质炎的猴体出现脊髓炎症细胞浸润,少量神经元变性,脊髓神经元变性坏死、卫星现象、噬神经细胞现象、血管周围炎症细胞袖套状浸润和胶质细胞增生;主要为CD4+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞和CD68+小胶质细胞大量浸润在血管袖套和增生的胶质结节中;在发生和未发生脊髓灰质炎的猴体中,CD155分布未见明显差别,均表达在神经元和胶质细胞,而血管内皮细胞未见表达.结论 脊髓灰质炎疫苗毒力返强导致典型病毒性脑脊髓炎.

目的 探讨miR-17-5p过表达调控信号转导子与转录活化子1(signal transducers and activators of transcription 1,STAT1)对Aβ1-42诱导人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞损伤的影响.方法 常规培养SH-SY5Y细胞系,应用Trypan染色进行形态学观察,Cell Counting Kit-8测定增殖活性;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法检测毒力;荧光探针法测定氧活性;实时荧光定量多聚核苷酸链式反应方法检测miR-17-5p、STAT1 mRNA的表达;免疫印迹试验法检验STAT1基因的表达.结果 与对照组比较,Aβ1-42组细胞STAT1 mRNA与蛋白水平、增殖抑制率、细胞毒性、活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高(P＜0.05),miR-17-5p水平降低(P＜0.05);与Aβ1-42组比较,mimics NC组数据无统计学意义(P＞0.05),miR-17-5p mimics 组数据降低(P＜0.05);与 miR-17-5p mimics 组比较,miR-17-5p mimics 组+pcDNA3.1组数据无统计学意义(P＞0.05),miR-17-5p mimics组+pcDNA3.1 STAT1组数据升高(P＜0.05).与对照组、mimics-NC组比较,miR-17-5p mimics组SH-SY5Y细胞中STAT1 mRNA与蛋白水平降低(P＜0.05).结论 miR-17-5p的过表达可以作为STAT1的靶向负调节,从而对SH-SY5Y细胞的损害起到一定的保护作用.

目的 探讨非结构蛋白氨基酸突变(NS1-G53D、NS3-E250V)对登革病毒(Dengue virus,DENV)4型Ban 18HK20株增殖及毒力的影响.方法 通过与DENV减毒株(PDK53)进行序列比对,确定Ban18HK20株突变位点;采用同源重组技术构建点突变质粒pSPTM-Ban18HK20(G53D)、pSPTM-Ban18HK20(E250V)、pSPTM-Ban18HK20(G53D+E250V),酶切及基因测序鉴定点突变质粒;体外转录获得病毒RNA,电转染Vero细胞拯救获得点突变病毒;通过蚀斑试验、间接免疫荧光试验、病毒全基因组测序、生长动力学试验、CCK-8试验和小鼠神经毒力试验对点突变病毒进行生物学特性鉴定.结果 酶切及测序证实点突变质粒构建正确.免疫荧光试验及病毒测序结果显示病毒拯救成功.点突变病毒比母本病毒蚀斑小.Ban18HK20(G53D)、Ban18HK20(E250V)、Ban18HK20(G53D+E250V)的病毒滴度第4天达峰值,分别为7.67、7.84、7.78 LgPFU/mL;母本病毒第5天达峰值,为7.68 LgPFU/mLo Ban18HK20(G53D)感染的BHK21细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高(P=0.003 6);Ban18HK20(G53D)、Ban18HK20(G53D+E250V)感染的C6/36细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高(P＜0.000 1).点突变病毒与母本病毒对 4 周龄 BALB/c 小鼠均无神经毒力;点突变病毒 Ban 18HK20(E250V)(LD50=8.51 PFU)、Ban 18HK20(G53D+E250V)(LD5o=0.69 PFU)对3日龄BALB/c乳鼠的神经毒力低于母本病毒(LD50=0.69 PFU);等量病毒经脑内注射后,点突变病毒Ban18HK20(G53D+E250V)对裸鼠的存活率(60％)高于母本病毒(0).点突变病毒遗传稳定,在Vero细胞上传至第10代未出现回复突变.结论 非结构蛋白NS1-G53D氨基酸突变减弱了 Ban18HK20株对C6/36和BHK21细胞的毒性,双点联合突变可减弱Ban18HK20株在裸鼠体内的神经毒力.本研究为DENV毒力位点研究及疫苗研发奠定了基础.

目的 探讨脊髓注射法猴体神经毒力试验对肠道菌群的影响.方法 用Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗进行脊髓法猴体神经毒力试验,收集3只神经毒力试验恒河猴及3只健康恒河猴粪便样本,提取细菌总DNA,采用新一代高通量测序技术对16S rRNA基因的V3～V4高变区测序并进行物种分类、丰度及多样性分析.结果 神经毒力试验对动物脊髓造成不同程度的病理损伤;试验组粪便微生物多样性降低,门水平上两组菌群无差异,优势菌群主要为硬壁菌门、变形菌门及拟杆菌门,占比总和超过95％;属水平上有普雷沃菌属(Prevotella)、芽殖菌属(Gemmiger)等11种菌属存在显著差异(P＜0.05).结论 脊髓注射法猴体神经毒力试验对动物造成脊髓损伤并引起粪便内乳酸菌属(Lactobacillus)、普雷沃菌属(Prevotella)及芽殖菌属(Gemmiger)等菌属组成变化,为建立非人灵长类动物脊髓损伤模型提供理论依据.

为查明贵州省遵义地区某规模化养殖场猪只发生急性死亡的病因,以及明确病原主要毒力基因的分子特征.本试验采用PCR技术、细胞接种试验、动物试验及透射电子显微镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对该病原的主要毒力基因进行克隆、测序及生物信息学分析.结果显示:PCR检测可扩增出PRV特异性核酸阳性条带,接种Vero细胞后可见明显CPE现象,在透射电子显微镜下可见囊泡中呈圆形、160 nm左右的成熟病毒粒子,胞核中可见病毒包涵体和实心、空心2种无囊膜病毒粒子;接种健康猪可引起神经症状,最后麻痹死亡;通过生物信息学分析显示该毒株的gE、gC、gD及TK基因序列均与参考毒株中湖北HNX株和河南HN1201株相对应的核苷酸同源性最高,且在gE基因的48位和496位都有1个天冬氨酸(Asp)的插入;根据gE、gC、gD及TK基因序列的遗传进化树结果显示本次分离毒株与2011年以后所分离鉴定的变异毒株属同一分支.说明本试验成功分离鉴定一株猪伪狂犬病病毒变异毒株,以期为贵州省猪伪狂犬病病毒的流行及变异提供一些参考.

目的 评价基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术快速区分携带rmpA2毒力基因的高毒力肺炎克雷伯菌的能力.方法 对浙江大学医学院附属第二医院和河南省人民医院的57株肺炎克雷伯菌,PCR扩增rmpA2毒力基因和荚膜血清型基因,多位点序列分型方法(MLST)进行分型,拉丝试验进行高黏液表型测定.MALDI-TOF MS对肺炎克雷伯菌进行鉴定并对峰图进行二维分析和算法统计,包括采用支持向量机算法(SVM),遗传算法(GA),监督使神经网络算法(SNN)和快速分类算法(QC)进行数据分析并建立相应模型,得到分型区分的特征峰.结果 57株肺炎克雷伯菌中有28株携带rmpA2毒力基因,MLST均为ST11型,其中拉丝试验阳性有5株;29株不携带rmpA2毒力基因,主要ST型为ST11(n=23),还包括ST15(n=3),ST1、ST76和ST473各一株.质谱将肺炎克雷伯菌较清晰地划分成两个区域,ClinProTools软件可准确区分84.2%(48/57)的菌株.ClinProTools软件四种算法结果基本相似,SVM特异性和灵敏度最高,分别为93.23%和100%.采用ClinProTools对质谱峰进行统计显示,得到区分rmpA2基因阳性组和阴性组的2个特征峰分别为7168.9和7280.76,在峰强度上存在一定的差异.结论 MALDI-TOF MS快速区分携带rmpA2毒力基因的高毒力肺炎克雷伯菌方法灵敏度和特异性都在90%以上,得到两个特征峰在峰强度上存在一定差异,需进一步验证.