目的:建立并优化人冠状病毒NL63参考株(HCoV-NL63-NC_005831)的体外富集方法。方法:以恒河猴肾细胞系(LLC-MK2)培养HCoV-NL63，以离心力135 000× g、分别离心病毒培养上清4 h、6 h、8 h、10 h和12 h以富集病毒，并以商品化PEG沉淀试剂盒富集方法作为对照。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、半数组织培养感染剂量(TCID 50)和空斑实验对原始病毒液、富集病毒液分别进行病毒核酸和病毒生物活性定量检测，评价病毒富集效果；通过透射电镜负染观测病毒富集前后的形态。 结果:经层超速离心法及经PEG沉淀法分别进行体积100∶1富集处理，两种方法获得的富集病毒液相较于原液的病毒核酸浓度及活病毒浓度均有提高( P<0.001)。超速离心方法富集前后，电镜下观察到的病毒颗粒呈正常的负染形态；4 h、6 h、8 h、10 h和12 h超速离心后活病毒浓度平均分别是原病毒液的(7.35±1.62)倍、(13.98±1.71)倍、(36.36±10.41)倍、(48.16±9.38)倍、(54.26±7.02)倍，PEG沉淀后活病毒浓度是原病毒液的(3.39±0.16)倍，经超速离心法获得的富集病毒液的核酸浓度及活病毒浓度显著高于PEG沉淀法( P<0.05)；8 h、10 h、12 h超速离心后病毒浓度显著高于4 h和6 h( P<0.05)，但8 h、10 h、12 h之间病毒含量差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:超速离心法相较于商品化的PEG沉淀法能更有效富集HCoV-NL63病毒；离心力为135 000× g时，选择8 h的超离时间可获得较优的体外富集效果。

目的:探讨健康恒河猴口轮匝肌（orbicularis oris muscle，OOM）不同运动模式下的肌电信号特征及产生收缩运动的起始阈电压值。方法:于不同时间点应用肌电图与诱发电位仪，采集健康恒河猴OOM安静持续闭口状态时肌电幅值、自然闭口起始阈电压值及持续闭口状态下的起始阈电压值时的肌电信号，分析肌电信号的电压幅值变化情况，确立OOM收缩运动起始肌电信号的幅值区间。采用单因素方差分析法对数据进行统计学分析。结果:定性分析结果示：健康猴OOM安静自然持续闭口状态的肌电图呈直线形，较平稳，绝对值波动在15~50 μV之间；自然口唇收缩运动时肌电图的肌电波形迅速升高，其幅值波动较大，最高峰值绝对值可达数百微伏；而诱发持续闭口状态的肌电图其幅值高达数千微伏以上。定量分析结果示：在不同测试时间点下的健康恒河猴OOM安静自然持续闭口状态下的肌电幅值间比较，差异均无统计学意义（ P值均>0.05）；不同测试时间点下的健康恒河猴双侧OOM自然闭口运动状态时的阈电压值（平均值范围：57.17~57.47 μV）和诱发持续闭口状态下引发OOM收缩的阈电压值（平均值范围：55.38~55.99 μV）比较显示差异均无统计学意义（ P值均>0.05）。安静自然持续闭口状态为（30.67±8.72）μV，自然闭口运动状态为（475.12±54.72）μV，诱发持续闭口状态为（921.22±312.79）μV，3种口唇运动模式下OOM肌电幅值绝对值的两两比较差异均有统计学意义（ t值分别为-8.48、-9.35、-5.01， P值均<0.001）。 结论:OOM的肌电信号在不同运动模式下各具特点，可作为计算机判断识别此肌运动模式的依据，不同运动状态下的肌电阈电压值上限为55~60 μV之间。

目的:研究sonic hedgehog(Shh)信号通路核转录因子Gli1/Gli2在恒河猴轮状病毒(RRV)感染致胆道闭锁小鼠肝脏上皮间充质化(EMT)中的调控作用。方法:通过RRV构建胆道闭锁小鼠模型，根据RNA干扰技术对Shh信号通路关键转录因子Gli1/Gli2表达调控的不同，将实验小鼠分为正常组、模型组、Gli1过表达组、Gli1 shRNA组、Gli2过表达组、Gli2 shRNA组，应用实时荧光定量聚合酶链反应及蛋白质印迹法检测实验小鼠肝脏组织中EMT关键调控因子Snail/Slug及EMT特征性细胞因子波形蛋白(Vimentin)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA及蛋白的表达；对不同分组中的小鼠肝脏组织分别行苏木精-伊红染色和Masson染色观察记录肝纤维组织表达面积百分比。采用单因素方差分析和 LSD- t检验进行数据分析。 结果:Gli2过表达组、Gli2 shRNA组及模型组Snail、Slug、Vimentin、α-SMA、E-cadherin mRNA相对表达量分别为15.13±3.40、5.48±0.46、8.78±1.06、12.40±2.18和3.06±0.53；3.73±1.16、5.62±1.75、3.56±1.06、3.88±1.16和10.51±1.83；8.13±1.27、5.32±0.98、5.05±0.98、4.02±0.77和5.12±1.60。与模型组相比，Gli2过表达组Snail、Vimentin、α-SMA的mRNA表达明显升高，E-cadherin的mRNA表达明显降低，差异均有统计学意义( t＝4.53、5.29、8.12、-2.13，均 P<0.05)；与模型组相比，Gli2 shRNA组Snail、Vimentin的mRNA表达明显降低，E-cadherin的mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义( t＝-2.86、-2.12、5.62，均 P<0.05)。Gli2过表达组、Gli2 shRNA组及模型组Snail、Slug、Vimentin、α-SMA、E-cadherin蛋白灰度比值分别为2.02±0.39、0.31±0.08、0.95±0.17、1.07±0.17和0.42±0.06；0.53±0.13、0.40±0.18、0.20±0.04、0.28±0.07和1.09±0.31；0.70±0.15、0.42±0.22、0.64±0.13、0.81±0.11和0.42±0.09。与模型组相比，Gli2过表达组Snail、Vimentin、α-SMA蛋白灰度比值明显升高，差异均有统计学意义( t＝12.71、4.28、3.70，均 P<0.05)；与模型组相比，Gli2 shRNA组Vimentin、α-SMA表达明显降低，E-cadherin表达明显升高，差异均有统计学意义( t＝-6.14、-7.57、5.96，均 P<0.05)。Gli1过表达组及Gli1 shRNA组小鼠肝脏组织未见明确EMT特征细胞因子表达变化趋势。正常组、模型组、Gli1过表达组、Gli1 shRNA组、Gli2过表达组、Gli2 shRNA组肝脏纤维组织表达面积百分比分别为(1.03±0.58)%、(33.02±11.39)%、(39.81±5.67)%、(26.06±1.29)%、(49.81±8.57)%和(17.55±0.66)%。Gli2过表达组及Gli2 shRNA组与模型组肝脏纤维组织表达面积百分比相比，差异均有统计学意义( t＝3.21、-2.96，均 P<0.05)；Gli1过表达组及Gli1 shRNA组与模型组肝脏纤维组织表达面积百分比相比，差异均无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:Shh信号通路在胆道闭锁小鼠肝纤维化中起重要作用，Shh信号通路关键转录因子Gli2可显著调控胆道闭锁小鼠肝脏EMT过程。

目的:探讨胆道闭锁(biliary atresia，BA)小鼠生存晚期的脑损伤情况及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)对BA小鼠脑损伤的治疗作用。方法:将160只新生BALB/c小鼠按随机数字表法平均分为疾病组、空白对照组、治疗组及药物对照组，每组各40只。疾病组出生后第3天腹腔注射30 μl恒河猴轮状病毒(rhesus rotavirus，RRV)诱导BA小鼠模型；治疗组出生后第3天注射等量RRV后每日腹腔注射10 mg/kg的NAC治疗至第12天；空白对照组出生后第3天予腹腔注射30 μl未扩增RRV的MA104细胞培养上清；药物对照组出生后第3天起每日腹腔注射10 mg/kg的NAC至第12天。取第19天小鼠进行神经功能评分，检测血浆脑损伤标志物神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)和中枢神经特异蛋白S100β水平。评估小鼠海马锥体细胞层病理切片苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色、尼氏染色及Iba1免疫组织化学染色情况。评估小鼠肝门管区HE染色、细胞角蛋白19(cytokeratin 19，CK19)免疫组织化学染色及天狼猩红染色情况。组间样本神经功能评分、血浆脑损伤标志物水平比较采用 t检验，组间样本海马锥体细胞层HE染色评分、尼氏染色评分、Iba1免疫组织化学染色评分比较采用Wilcoxon秩和检验。 结果:生后第19天疾病组小鼠神经功能评分中一般评分及局灶评分分别为(10.24±1.27)分、(6.84±1.05)分，与空白对照组小鼠均为0分比较，一般评分( t＝－39.90， P<0.001)、局灶评分( t＝－32.03， P<0.001)差异均有统计学意义。出生后第19天治疗组小鼠神经功能评分中一般评分及局灶评分分别为(4.84±0.92)分、(1.88±0.59)分，与疾病组小鼠比较，一般评分( t＝16.81， P<0.001)、局灶评分( t＝20.25， P<0.001)差异均有统计学意义。出生后第19天药物对照组小鼠神经功能评分一般评分及局灶评分均为0分。疾病组与空白对照组小鼠血浆NSE水平分别为(27.79±2.50)ng/ml、(18.93±2.78)ng/ml，差异有统计学意义( t＝－10.63， P<0.001)，治疗组血浆NSE水平为(23.08±1.96)ng/ml，与疾病组比较，差异有统计学意义( t＝6.64， P<0.001)。药物对照组血浆NSE水平为(18.95±2.79)ng/ml，与空白对照组比较差异无统计学意义( t＝－0.02， P＝0.983)。疾病组与空白对照组血浆S100β水平分别为(285.01±27.84)pg/ml、(180.77±35.52)pg/ml，差异有统计学意义( t＝－10.33， P<0.001)，治疗组血浆S100β水平为(218.29±31.02)pg/ml，与疾病组比较，差异有统计学意义( t＝7.16， P<0.001)。药物对照组血浆S100β水平为(188.11±46.29)pg/ml，与空白对照组比较差异无统计学意义( t＝－0.57， P＝0.571)。疾病组HE染色评分0、1、2分视野数量为8、17、5个，空白对照组HE染色评分均为0分，差异有统计学意义( Z＝－5.74， P<0.001)。治疗组HE染色评分0、1、2分视野数量为17、13、0个，与疾病组比较，差异有统计学意义( Z＝－2.77， P＝0.006)。药物对照组所有视野HE染色评分均为0分。疾病组尼氏染色评分0、1、2分视野数量为6、19、5个，空白对照组尼氏染色评分均为0分，差异有统计学意义( Z＝－6.14， P<0.001)。治疗组尼氏染色评分0、1、2分视野数量为22、8、0个，与疾病组比较，差异有统计学意义( Z＝－4.28， P<0.001)。药物对照组所有视野尼氏染色评分均为0分。疾病组Iba1免疫组织化学染色阴性、弱阳性、阳性、强阳性视野数量分别为1、0、14、0个，空白对照组阴性、弱阳性、阳性、强阳性视野数量分别为13、1、1、0个，差异有统计学意义( Z＝－4.57， P<0.001)。治疗组小鼠Iba1免疫组织化学染色阴性、弱阳性、阳性、强阳性视野数量分别为10、3、2、0个，与疾病组相比，差异有统计学意义( Z＝－4.11， P<0.001)。第19天药物对照组小鼠Iba1染色阴性、弱阳性、阳性、强阳性视野数量分别为13、2、0、0个，与空白对照组相比，差异无统计学意义( Z＝－0.07， P＝0.944)。肝门管区HE染色见疾病组炎症细胞浸润，治疗组炎症细胞浸润减少。肝门管区CK19免疫组织化学染色可见疾病组胆管缺如，治疗组可见少量发育不全的胆管。肝门管区天狼猩红染色可见疾病组大量肝组织纤维化，治疗组肝组织纤维化减少。 结论:BA小鼠生存晚期存在脑损伤，早期使用NAC治疗可以减轻其脑损伤。

目的:探讨多基因编辑猪心实施异种异位心脏移植后心功能的变化趋势，及受体免疫反应对供体心脏的影响，为基因编辑技术应用于临床领域提供实验基础。方法:2023年12月16日完成猪－恒河猴异种异位心脏移植，观察移植术后负荷状态下移植物功能状态及受体免疫指标。结果:受体猴已存活40天，供、受体心脏功能良好，未出现超急性和急性免疫排斥反应。结论:多基因编辑技术为异种移植提供了可能，但临床应用仍需要继续深入研究。

目的:通过研究中国恒河猴外周血淋巴细胞免疫表型及其功能，为以恒河猴为模型的研究提供数据参考。方法:通过优选抗体克隆和荧光配色，确定了主要淋巴细胞亚群检测和T细胞功能检测Panel，并用此方法分析15只健康中国恒河猴外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中T、B、NK等多种细胞亚群的比例，以及在非特异性刺激条件下T细胞分泌细胞因子的能力。结果:成功建立了两套多色流式Panel，Panel 1可同时检测细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte, CTL)、滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell, Tfh)、调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)、B细胞和NK细胞等多种淋巴细胞亚群，Panel 2可检测多种T细胞亚群功能和免疫检查点分子的表达。中国恒河猴PBMCs中主要淋巴细胞亚群比例的平均值分别为T细胞(75.32±7.73)%、B细胞(13.22±7.50)%、NK细胞(0.88±0.48)%、Tfh细胞(0.73±0.27)%、Treg细胞(0.75±0.43)%、CD16 +NK细胞(47.87±22.35)%、CD56 +NK细胞(10.69±12.41)%。非特异性刺激后，分泌IL-2和TNF-α的CD4 +T细胞比例高于CD8 +T细胞，分泌CD107a和IFN-γ的CD8 +T细胞比例高于CD4 +T细胞，而这两种细胞分泌IL-17A的比例均较低。 结论:本研究建立了可在单细胞水平同时检测多个细胞表面分子和分泌因子的多色流式检测方案，能够准确、全面地分析恒河猴PBMCs中免疫细胞亚群、免疫功能以及免疫检查点分子的表达，为利用恒河猴模型进行传染病疫苗及药物研发提供新的实验方法和基础数据。

目的:观察高糖状态下 NDRG1对恒河猴视网膜血管内皮细胞（RF/6A细胞）增殖、迁移和管腔形成能力的影响。 方法:将RF/6A细胞分为正常组、甘露醇组、高糖组、无靶基因的小干扰RNA （siRNA）阴性对照组（siRNA组）、30 nmol/L siRNA下调 NDRG1基因组（siNDRG1组）、50 nmol/L siNDRG1组。正常组细胞常规培养；甘露醇组细胞加入25 mmol/L甘露醇培养；高糖组细胞加入25 mmol/L葡萄糖培养；siRNA组细胞加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA诱导培养；30、50 nmol/L siNDRG1组细胞均加入25 mmol/L葡萄糖，再分别用30、50 nmol/L siNDRG1进行诱导。所有细胞均孵育24 h进行后续实验。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色观察细胞增殖；细胞计数试剂盒8染色检测细胞活性；实时定量聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹法检测细胞中 NDRG1基因的mRNA和蛋白表达水平；细胞划痕实验观察细胞迁移；细胞管腔形成实验检测管腔形成。两组间比较采用双尾Student t检验；多组间比较采用单因素方差分析。 结果:高糖组与正常组、甘露醇组细胞增殖率（ t=36.659、57.645）、迁移率（ t=24.745、33.638）、管腔形成数量（ t=41.276、22.867）比较，差异均有统计学意义（ P<0.01）。与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞中 NDRG1基因的mRNA和蛋白相对表达量显著降低，差异有统计学意义（ t=46.145、21.541、36.738、32.976， P<0.001）。与siRNA组比较，30 nmol/L siNDRG1组、50 nmol/L siNDRG1组细胞中 NDRG1基因的mRNA和蛋白相对表达量明显降低，差异有统计学意义（ t=44.275、40.7577、57.167、25.877， P<0.01）。与正常组、siRNA组比较，30 nmol/L siNDRG1组细胞迁移率增加，差异有统计学意义（ t=57.562、49.522， P<0.01）。与正常组、siRNA组比较，30 nmol/L siNDRG1组相同视野下细胞管腔形成数量明显增加，差异有统计学意义（ t=63.446、42.742， P<0.01）。 结论:下调 NDRG1基因可诱导高糖状态下RF/6A细胞活性、细胞迁移和管腔形成能力的提高。

目的:探讨稳定的猪-猴异种原位全肝移植模型制作方法，为异种肝移植的临床前研究提供良好的实验工具。方法:回顾性分析中南大学湘雅二医院异种肝脏移植研究团队施行的7例猪-猴异种原位全肝移植的围手术期情况及结局。供体选用基因编辑的版纳小型猪，受体选用解剖特征、生理生化及免疫机制同人类十分接近的恒河猴。在参照临床经典原位全肝移植术式的基础上，进行猪-猴异种原位全肝移植术，并对手术过程进行改进，以减少术中出血、缩短无肝期。在胆管插管留置外引流，以观察胆汁分泌情况。术前免疫诱导采用"抗胸腺细胞球蛋白+利妥昔单抗+眼镜蛇毒因子+他克莫司"；术后免疫维持采用"他克莫司+吗替麦考酚酯+甲泼尼龙"，同时给予抗菌抗病毒治疗、输注凝血酶调节受体凝血功能。结果:共行猪-猴异种原位全肝移植7例，在建模成熟稳定的第7例模型制作中，供体获取手术时间42 min，无热缺血时间，供体修整时间87 min，供体冷保存时间为128 min；受体手术时间123 min，无肝期27 min，肝下下腔静脉阻断38 min，手术全程出血量约10 ml。术后存活4例，术后最长存活时间为27 h。3例未存活模型中，1例为麻醉意外，2例为早期手术练习。第7例模型受体术后分泌胆汁86 ml。结论:良好的供体获取、高质量的血管吻合、术中减少出血量、缩短无肝期、严格的液体管理及细致全面的监护是提高猪-猴异种肝移植模型成功率的关键，优化供体基因组合及合理免疫抑制方案是进一步实现猪-猴异种肝移植模型长期存活的关键。

目的:探究人与非人灵长类动物（恒河猴）的下颌骨骨膜中是否存在有别于传统间充质干细胞的干细胞群体及其在膜内成骨过程中的特性，并提供区别于其他解剖区域骨膜干细胞（PSC）的下颌骨PSC的稳定分离、培养、扩增的标准化流程。方法:分别从上海交通大学医学院附属第九人民医院的18~24岁行第三磨牙拔除术3例患者翻瓣去骨过程中的骨块表面和3只6岁龄恒河猴下颌骨的磨牙区颊侧获取骨膜，使用Illumina平台Novaseq 6000测序仪进行单细胞测序，并通过同源基因匹配进行跨物种单细胞转录组测序的结果比较。使用37 ℃和低温两种消化方式从原代组织中分离PSC，经流式细胞术分析鉴定其表面标志物（CD200、CD31、CD45和CD90）并通过免疫荧光鉴定组织蛋白酶K（CTSK）与CD200的共定位情况。评估体外扩增至第3代的不同物种PSCs的细胞增殖能力和三系分化能力。比较PSC和骨髓间充质干细胞（BMSC）在成骨方面的特性异同。结果:单细胞测序结果提示直系同源基因匹配降维后获得了18个聚类的细胞群，基于各细胞标志物数据库对各聚类进行细胞注释。低温消化方案可以稳定地从人、恒河猴下颌骨骨膜中分离出PSC，细胞呈成纤维细胞状。细胞计数法结果显示人与恒河猴的PSC增殖能力差异无统计学意义，流式细胞术分析鉴定结果显示，从骨膜分离的细胞表面抗原表达CD200 +、CD31 -、CD45 -和 CD90 -，免疫荧光提示CTSK与CD200共定位于此细胞中。茜素红染色、油红O染色和阿尔辛蓝染色结果显示，人和恒河猴的PSC均具备成骨、成脂、成软骨的分化能力。与BMSC的成骨能力相比，PSC增殖能力略优，分化过程中，PSC在早期有良好的成骨表现。 结论:本研究成功稳定分离并鉴定出人和非人灵长类动物（恒河猴）的正常下颌骨PSC，为探索下颌骨膜内成骨的机制、建立理想的非人灵长类动物模型以及下颌骨缺损修复新型策略提供了细胞学基础。

目的:表达纯化猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原蛋白并分析三种蛋白在痘苗病毒免疫血清检测中的应用。方法:将猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原按照人源密码子优化合成后插入pVRC载体，转染HEK293T细胞后收获上清，通过Western blot方法验证蛋白表达，通过镍柱和离子交换层析柱纯化蛋白，并采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度。分别以纯化A29L、B6R与M1R作为包被抗原，通过ELISA检测痘苗病毒免疫后的小鼠、恒河猴与人血清中IgG抗体滴度，并分析它们与血清中抗痘苗病毒、抗猴痘病毒中和抗体滴度的相关性。结果:猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白在细胞上清中均可大量分泌表达。经镍柱及离子交换层析柱进行蛋白纯化后，纯度均可达90%以上。痘苗病毒免疫的动物与人血清中均可检出针对三种蛋白特异的IgG抗体，三个抗原检测的IgG滴度显著相关，痘苗免疫血清中A29L、B6R、M1R特异的IgG与抗痘苗病毒中和抗体水平也显著相关，但与抗猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。结论:在痘苗病毒免疫血清中可检测到与猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白交叉反应的IgG抗体，且IgG滴度与抗痘苗病毒中和抗体水平显著相关，但与猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。该研究可为正痘（包括猴痘）病毒免疫学检测方法的应用及疫苗研发提供参考。