目的:构建同时表达神经纤毛蛋白质1(NRP-1)和存活素(Survivin)双基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒，通过体内外实验，观察其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响。方法:构建同时表达NRP-1和Survivin双基因的质粒(Plasmid-1)，并构建单独表达NRP-1和Survivin基因质粒(分别为Plasmid-2、Plasmid-3)。转染入鼻咽癌CNE-2Z细胞株，于荧光显微镜观察质粒转染及表达情况；以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力；定量聚合酶链反应(PCR)及免疫印迹法(Western blot)在mRNA水平和蛋白水平上检测目的基因抑制作用。建立稳定转染裸鼠移植瘤模型，体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果。原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测移植瘤细胞凋亡率。多组间比较采用单因素方差分析。结果:通过测序证实重组shRNA真核表达载体构建成功。各重组质粒表达载体成功转染CNE-2Z细胞，可见大量的癌细胞表达绿色荧光。MTT显示细胞增殖受到抑制，且双基因干扰质粒对细胞增殖的抑制作用明显强于单基因干扰质粒，差异有统计学意义(0.209±0.021比0.392±0.013、0.384±0.014， F＝354.121， P<0.05)。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实双基因联合沉默组和单基因沉默组均能有效抑制目的基因mRNA表达，双基因组NRP-1 mRNA(0.20±0.06)表达明显低于NRP-1单基因组(0.27±0.05)，差异有统计学意义( F＝198.437， P<0.05)；双基因组Survivin mRNA表达(0.13±0.02)明显低于Survivin单基因组(0.17±0.01)，差异有统计学意义( F＝245.647， P<0.05)。Western blot检测结果双基因组对NRP-1和Survivin蛋白的表达抑制率分别为67.41%和79.24%，与单基因组比较均有统计学意义( F＝129.354、216.411， P<0.05)。体内抑瘤实验证实，与NRP-1单基因干扰组[(0.628±0.013) cm 3]、Survivin单基因干扰组[(0.601±0.301) cm 3]比较，双基因干扰组[(0.205±0.002) cm 3]瘤体积生长明显受到抑制，差异有统计学意义( F＝49.214， P<0.05)，抑瘤率为81.71%。TUNEL实验表明双基因干扰组凋亡指数[(49.84±1.98)%]，显著高于NRP-1单基因组[(21.53±2.01)%， P<0.05]和Survivin单基因组[(19.91±2.11)%]，差异有统计学意义( F＝254.130， P<0.05)。 结论:同时表达两个不同基因的shRNA质粒载体转染鼻咽癌细胞后，可同时敲降NRP-1和survivin基因表达，与单个基因沉默比较，可以更好的促进细胞凋亡，抑制细胞生长增殖。

目的:探讨神经纤毛蛋白1(NRP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)在多形性胶质母细胞瘤(GBM)复发和耐药性中的机制。方法:体外培养人源性GBM1A和GBM22细胞株，通过感染慢病毒shRNA的方式沉默VEGF或NRP-1。根据感染慢病毒shRNA的种类，将两种细胞株分别分为shCont组(感染无义序列shRNA)、shNRP-1组(感染NRP-1慢病毒shRNA)及shVEGF组(感染VEGF慢病毒shRNA)。采用实时荧光定量聚合酶联链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法检测肿瘤细胞株在沉默NRP-1或VEGF基因后干细胞标志物[包括：性别决定区Y盒2(Sox2)、表皮生长因子受体(EGFR)、N-钙黏附素(N-cadherin)、CD133、细胞间质上皮转换因子(c-Met)]的基因和蛋白表达情况。采用细胞划痕实验、Transwell小室测定法、神经球形成实验及MTT法检测肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力、神经球形成能力及细胞代谢活性。采用细胞生长抑制实验检测肿瘤细胞株在沉默VEGF或NRP-1后对替莫唑胺(TMZ)、紫杉醇(PTX)和卡博替尼(XL-184)的敏感性。向GBM1A和GBM22细胞株中的shCont组和shNRP-1组分别加入10 μg重组VEGF，分为shCont组、shCont+VEGF组、shNRP-1组、shNRP-1+VEGF组，判断NRP-1与VEGF之间的相互作用。结果:GBM1A细胞株中，shVEGF组和shNRP-1组Sox2、EGFR、N-cadherin，CD133及c-Met的mRNA含量均较shCont组下降(均 P<0.05)。GBM1A细胞株中，shNRP-1组和shVEGF组EGFR、CD133、N-Cadherin的蛋白质相对表达量、24 h和48 h时的细胞划痕愈合率及发生细胞迁移的比例均较shCont组低(均 P<0.05)，但shNRP-1组和shVEGF组间的差异均无统计学意义(均 P>0.05)；GBM22细胞株得到相似的结果。在GBM1A细胞株和GBM22细胞株中，3组细胞活力的差异均无统计学意义(均 P>0.05)。根据绘制的剂量-生长曲线，GBM1A细胞株中，shNRP-1组和shVEGF组TMZ、PTX、XL-184的半抑制浓度(IC 50)均低于shCont组(均 P<0.05)；在GBM22细胞株得到相似的结果(均 P<0.05)。GBM1A细胞株中，shCont组和shCont+VEGF组形成神经球的数量均高于shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组(均 P<0.05)，其中shCont+VEGF组高于shCont组( P<0.05)，而shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组间的差异无统计学意义( P>0.05)；GBM22细胞株得到相似的结果。 结论:沉默VEGF或NRP-1基因在不影响GBM本身活力的情况下可有效抑制其干细胞性，降低其迁移能力及侵袭力，并恢复其对化疗药物的敏感性；VEGF介导的细胞迁移可能依赖NRP-1发挥作用。

目的 探讨环状人网状蛋白4(CircRTN4)调节miR-582-5p/神经纤毛蛋白1(NRP1)轴对结直肠癌(CRC)细胞恶性生物学行为的影响.方法 选取2019年1月至2023年1月河南科技大学第一附属医院收治的CRC患者50例,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹法分别检测患者的癌组织、癌旁组织、人正常结肠黏膜上皮细胞和CRC细胞中CircRTN4、miR-582-5p mRNA及NRP1的蛋白表达;将SW480细胞分别转染si-RTN4、miR-582-5p inhibitor及相应对照,qRT-PCR检测转染效率;通过平板克隆实验、Transwell小室和流式细胞仪等研究CircRTN4对CRC细胞的影响;蛋白质免疫印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及NRP1蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验检测miR-582-5p与RTN4和NRP1的作用;构建肺癌裸鼠模型,分析敲低RTN4对肿瘤质量、体积及移植瘤中miR-582-5p、NRP1、Ki-67蛋白表达的影响.结果 在CRC组织和细胞系中,RTN4、NRP1表达升高,miR-582-5p表达降低(P<0.05);敲低RTN4,降低SW480细胞迁移、增殖与侵袭,下调PCNA、Bcl-2、MMP-2、NRP1表达,促进miR-582-5p、Bax表达及细胞凋亡(P<0.05);miR-582-5p作为RTN4靶点,下调miR-582-5p可减弱RTN4敲低对SW480细胞恶性行为的抑制作用(P<0.05);体内实验显示,抑制RTN4可降低移植瘤质量和体积,降低Ki-67、NRP1表达水平,升高miR-582-5p表达(P<0.05).结论 在CRC组织和细胞系中,CircRTN4高表达,敲低CircRTN4可能通过调节miR-582-5p/NRP1轴抑制CRC细胞的恶性行为.

目的 探讨神经纤毛及唾样蛋白2(NETO2)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的临床意义,及其敲低对OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法 使用基因表达谱交互分析(GEPIA)分析OSCC患者的癌组织和非癌组织中NETO2表达,并分析NETO2表达与OSCC患者总生存率的相关性.于2020年11月至2022年1月从广西科技大学第二附属医院获得124份癌标本及配对正常组织(距肿瘤边缘5 cm).通过蛋白质印迹法分析NETO2表达.在体外实验中,实验1将HSC-4细胞分为NETO2敲低(sh1、sh2)组和相应对照(NC)组;实验2将HSC-4细胞分为NETO2敲低(sh1、sh1+EGF)组和相应对照(NC)组.使用CCK-8、克隆形成和Transwell分析研究NETO2敲低对HSC-4细胞增殖、侵袭和迁移的影响.此外,在NETO2敲低的HSC-4细胞中加入ERK激动剂(EGF)进行拯救实验.结果 NETO2在OSCC组织中的表达异常高,并且NETO2高表达OSCC患者的预后较差.与NC组相比,sh1组和sh2组的细胞活力、集落形成能力、迁移和侵袭细胞数均显著降低(P＜0.05).基因本体论(GO)的基因集富集分析(GSEA)揭示了 OSCC细胞中NETO2的敲低导致ERK信号通路基因表达的显著变化.与sh1组相比,sh1+EGF组增加了 NETO2敲低细胞中ERK的表达(P＜0.05).此外,sh1+EGF组的NETO2敲低OSCC细胞的生长、集落形成能力、迁移和侵袭均显著高于sh1组(P＜0.05).结论 OSCC组织中高水平的NETO2表达与患者的不良预后相关.NETO2是一种重要的癌蛋白,可能激活ERK信号通路以促进OSCC细胞的增殖、侵袭和转移.

目的 制备131I标记的抗神经纤毛蛋白(NPR)-2单克隆抗体(mAb)(131I-anti-NRP-2-mAb),在体内外观察其与NRP-2表达阳性肿瘤的结合特性,以探讨其应用于NRP-2表达阳性肿瘤显像的可能性.方法 (1)采用氯胺T法制备131 I-anti-NRP-2-mAb,经Sephadex G25柱纯化,用薄层色谱法测定放化纯和稳定性.(2)利用A549细胞进行体外实验,测定131I-anti-NRP-2-mAb的结合率和受体的亲和力.(3)将A549荷瘤裸鼠以随机抽样法随机分为4组,每组4只,分别于尾静脉注射0.37 MBq131 I-anti-NRP-2-mAb,6、24、48和72h后,测定并计算主要器官及组织的放射性摄取值[每克组织百分注射剂量率(％ID/g)]、肿瘤/肌肉放射性(T/M)比值和肿瘤/血液放射性(T/B)比值.(4)将A549荷瘤裸鼠以随机抽样法分为未阻断组和竞争性阻断组,每组3只,未阻断组经尾静脉注射3.7 MBq 131I-anti-NRP-2-mAb,竞争性阻断组经尾静脉注射同等剂量的标记物和100μg未标记的抗NRP-2 mAb,均分别于注射后6、24、48和72 h行γ显像,观察肿瘤放射性浓聚状况.采用两样本t检验分析数据.结果 (1)131 I-anti-NRP-2-mAb标记率为(94.69±3.63)％,放化纯为(98.56±0.48)％;室温下磷酸盐缓冲液中放置72 h,其标记率仍＞85％.(2) 131I-anti-NRP-2-mAb与A549细胞特异性结合率,在60、120、180和240 min时分别为(3.95±0.18)％、(5.19±0.65)％、(6.60±0.36)％和(5.58±0.63)％;加入过量未标记的anti-NRP-2-mAb后,下降至(0.94±0.31)％、(1.12±0.17)％、(1.24±0.25)％和(1.04±0.18)％,阻断组与未阻断组4个时间点细胞结合率间的差异具有统计学意义(t值:11.22、9.89、19.66和9.95,均P＜0.05);与A549细胞表面受体结合的半抑制浓度(IC50)值为(410.8±1.2) nmol/L.(3)注射131I-anti-NRP-2-mAb后,T/B比值和T/M比值均随着时间的延长逐渐增高,在72 h达到最高,分别为1.10±0.20和3.83±0.18.(4)γ显像示:未阻断组荷瘤鼠注射131I-anti-NRP-2-mAb后6h即可见肿瘤显影,48 h后肿瘤显像最清晰;竞争性阻断组荷瘤鼠在各时间点肿瘤均未见明显显影.结论 成功制备131I-anti-NRP-2-mAb,该标记物对NRP-2具有良好的靶向性.

目的 结肠癌的发生发展过程与肿瘤血管生成密切相关,神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肿瘤血管生成中发挥重要作用.本研究旨在探讨结肠癌组织NRP-1和VEGF表达及其预后的关系.方法 收集2010-08-01-2012-05-31南华大学附属南华医院普外胃肠病区手术切除、具有完整资料、术后经病理确诊的结肠癌及癌旁(＞5 cm)组织标本73例,采用免疫组织化学法检测NRP-1及VEGF在结肠癌及癌旁正常组织的表达;另外选取2016年南华大学附属南华医院切除结肠癌新鲜组织及癌旁组织(距癌组织＞5 cm)16对,采用蛋白质印迹法检测NRP-1及VEGF表达.结果 免疫组化结果显示,与结肠癌癌旁组织比较,结肠癌组织中NRP-1及VEGF呈高表达,x2=55.857,P＜0.001;x2=44.042,P＜0.001.蛋白质印迹法检测结果显示,新鲜结肠癌组织中NRP-1及VEGF蛋白呈高表达,而癌旁组织中表达降低,差异有统计学意义,t=-63.238,P＜0.001;t=-78.712,P＜0.001.结肠癌组织中NRP-1和VEGF高表达均与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结有无转移有关联,差异有统计学意义,P＜0.05;癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的数值与NRP-1表达有关联(x2=15.966,P=0.002),而与VEGF表达无统计学意义的关联,x2=0.061,P=0.862;Cox多因素回归分析显示,CEA(RR=4.851,95％CI:1.013～23.427)、肿瘤大小(RR=0.157,95％CI.0.017～1.228)、TNM分期(RR=5.419,95％ CI:2.179～32.479)、淋巴结转移(RR=0.137,95％CI:0.023～0.728)是NRP-1阳性表达的独立影响因素;生存分析显示,NRP-1阳性表达组患者生存周期短于阴性患者,x2=5.081,P=0.029.结论 NRP-1参与结肠癌的血管生成,并导致预后不良,提示NRP-1在结肠癌发生发展中起重要作用,为评估结肠癌预后及研究靶向药物提供新的思路.

目的:老年抑郁障碍的自杀和血管性痴呆等风险较高,本研究基于基因转录调控网络,整合并利用生物信息学分析,探索老年期抑郁症(geriatric depression,GD)的诊断生物标志物.方法:从公共数据库Gene Expression Omnibus(GEO)中下载基因表达谱数据集GSE76826.R软件鉴定GD与健康对照样本两组之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs).基于DAVID数据库对DEGs进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能注释、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析.STRING在线生物信息学工具对DEGs进行调控网络分析并构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,Cytoscape软件筛选枢纽基因.之后,采用pROC软件包进行受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析,筛选转录因子以获得诊断生物标志物.结果:与健康对照相比,GD样本中共鉴定出1411个DEGs.DEGs构建的PPI中共识别出4个关键模块.KEGG通路富集分析结果显示:DEGs在纤毛运动、抗菌体液反应、O-glycan加工、黏膜免疫反应、碳水化合物跨膜转运活动、激素生物合成、神经递质生物合成以及药物代谢酶P450通路中富集.从Cytoscape构建的PPI网络中获取15个转录因子,ROC分析表明转录因子LMO2和CEBPB对GD具有较高的诊断效能.结论:通过对公共数据集GSE76826的整合分析,获取可能成为GD潜在诊断生物标志物的转录因子,为深入了解GD的早期诊断提供新的视角.