目的:构建同时表达神经纤毛蛋白质1(NRP-1)和存活素(Survivin)双基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒，通过体内外实验，观察其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响。方法:构建同时表达NRP-1和Survivin双基因的质粒(Plasmid-1)，并构建单独表达NRP-1和Survivin基因质粒(分别为Plasmid-2、Plasmid-3)。转染入鼻咽癌CNE-2Z细胞株，于荧光显微镜观察质粒转染及表达情况；以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力；定量聚合酶链反应(PCR)及免疫印迹法(Western blot)在mRNA水平和蛋白水平上检测目的基因抑制作用。建立稳定转染裸鼠移植瘤模型，体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果。原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测移植瘤细胞凋亡率。多组间比较采用单因素方差分析。结果:通过测序证实重组shRNA真核表达载体构建成功。各重组质粒表达载体成功转染CNE-2Z细胞，可见大量的癌细胞表达绿色荧光。MTT显示细胞增殖受到抑制，且双基因干扰质粒对细胞增殖的抑制作用明显强于单基因干扰质粒，差异有统计学意义(0.209±0.021比0.392±0.013、0.384±0.014， F＝354.121， P<0.05)。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实双基因联合沉默组和单基因沉默组均能有效抑制目的基因mRNA表达，双基因组NRP-1 mRNA(0.20±0.06)表达明显低于NRP-1单基因组(0.27±0.05)，差异有统计学意义( F＝198.437， P<0.05)；双基因组Survivin mRNA表达(0.13±0.02)明显低于Survivin单基因组(0.17±0.01)，差异有统计学意义( F＝245.647， P<0.05)。Western blot检测结果双基因组对NRP-1和Survivin蛋白的表达抑制率分别为67.41%和79.24%，与单基因组比较均有统计学意义( F＝129.354、216.411， P<0.05)。体内抑瘤实验证实，与NRP-1单基因干扰组[(0.628±0.013) cm 3]、Survivin单基因干扰组[(0.601±0.301) cm 3]比较，双基因干扰组[(0.205±0.002) cm 3]瘤体积生长明显受到抑制，差异有统计学意义( F＝49.214， P<0.05)，抑瘤率为81.71%。TUNEL实验表明双基因干扰组凋亡指数[(49.84±1.98)%]，显著高于NRP-1单基因组[(21.53±2.01)%， P<0.05]和Survivin单基因组[(19.91±2.11)%]，差异有统计学意义( F＝254.130， P<0.05)。 结论:同时表达两个不同基因的shRNA质粒载体转染鼻咽癌细胞后，可同时敲降NRP-1和survivin基因表达，与单个基因沉默比较，可以更好的促进细胞凋亡，抑制细胞生长增殖。

目的:探讨神经纤毛蛋白1(NRP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)在多形性胶质母细胞瘤(GBM)复发和耐药性中的机制。方法:体外培养人源性GBM1A和GBM22细胞株，通过感染慢病毒shRNA的方式沉默VEGF或NRP-1。根据感染慢病毒shRNA的种类，将两种细胞株分别分为shCont组(感染无义序列shRNA)、shNRP-1组(感染NRP-1慢病毒shRNA)及shVEGF组(感染VEGF慢病毒shRNA)。采用实时荧光定量聚合酶联链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法检测肿瘤细胞株在沉默NRP-1或VEGF基因后干细胞标志物[包括：性别决定区Y盒2(Sox2)、表皮生长因子受体(EGFR)、N-钙黏附素(N-cadherin)、CD133、细胞间质上皮转换因子(c-Met)]的基因和蛋白表达情况。采用细胞划痕实验、Transwell小室测定法、神经球形成实验及MTT法检测肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力、神经球形成能力及细胞代谢活性。采用细胞生长抑制实验检测肿瘤细胞株在沉默VEGF或NRP-1后对替莫唑胺(TMZ)、紫杉醇(PTX)和卡博替尼(XL-184)的敏感性。向GBM1A和GBM22细胞株中的shCont组和shNRP-1组分别加入10 μg重组VEGF，分为shCont组、shCont+VEGF组、shNRP-1组、shNRP-1+VEGF组，判断NRP-1与VEGF之间的相互作用。结果:GBM1A细胞株中，shVEGF组和shNRP-1组Sox2、EGFR、N-cadherin，CD133及c-Met的mRNA含量均较shCont组下降(均 P<0.05)。GBM1A细胞株中，shNRP-1组和shVEGF组EGFR、CD133、N-Cadherin的蛋白质相对表达量、24 h和48 h时的细胞划痕愈合率及发生细胞迁移的比例均较shCont组低(均 P<0.05)，但shNRP-1组和shVEGF组间的差异均无统计学意义(均 P>0.05)；GBM22细胞株得到相似的结果。在GBM1A细胞株和GBM22细胞株中，3组细胞活力的差异均无统计学意义(均 P>0.05)。根据绘制的剂量-生长曲线，GBM1A细胞株中，shNRP-1组和shVEGF组TMZ、PTX、XL-184的半抑制浓度(IC 50)均低于shCont组(均 P<0.05)；在GBM22细胞株得到相似的结果(均 P<0.05)。GBM1A细胞株中，shCont组和shCont+VEGF组形成神经球的数量均高于shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组(均 P<0.05)，其中shCont+VEGF组高于shCont组( P<0.05)，而shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组间的差异无统计学意义( P>0.05)；GBM22细胞株得到相似的结果。 结论:沉默VEGF或NRP-1基因在不影响GBM本身活力的情况下可有效抑制其干细胞性，降低其迁移能力及侵袭力，并恢复其对化疗药物的敏感性；VEGF介导的细胞迁移可能依赖NRP-1发挥作用。

目的 探讨神经纤毛及唾样蛋白2(NETO2)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的临床意义,及其敲低对OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法 使用基因表达谱交互分析(GEPIA)分析OSCC患者的癌组织和非癌组织中NETO2表达,并分析NETO2表达与OSCC患者总生存率的相关性.于2020年11月至2022年1月从广西科技大学第二附属医院获得124份癌标本及配对正常组织(距肿瘤边缘5 cm).通过蛋白质印迹法分析NETO2表达.在体外实验中,实验1将HSC-4细胞分为NETO2敲低(sh1、sh2)组和相应对照(NC)组;实验2将HSC-4细胞分为NETO2敲低(sh1、sh1+EGF)组和相应对照(NC)组.使用CCK-8、克隆形成和Transwell分析研究NETO2敲低对HSC-4细胞增殖、侵袭和迁移的影响.此外,在NETO2敲低的HSC-4细胞中加入ERK激动剂(EGF)进行拯救实验.结果 NETO2在OSCC组织中的表达异常高,并且NETO2高表达OSCC患者的预后较差.与NC组相比,sh1组和sh2组的细胞活力、集落形成能力、迁移和侵袭细胞数均显著降低(P＜0.05).基因本体论(GO)的基因集富集分析(GSEA)揭示了 OSCC细胞中NETO2的敲低导致ERK信号通路基因表达的显著变化.与sh1组相比,sh1+EGF组增加了 NETO2敲低细胞中ERK的表达(P＜0.05).此外,sh1+EGF组的NETO2敲低OSCC细胞的生长、集落形成能力、迁移和侵袭均显著高于sh1组(P＜0.05).结论 OSCC组织中高水平的NETO2表达与患者的不良预后相关.NETO2是一种重要的癌蛋白,可能激活ERK信号通路以促进OSCC细胞的增殖、侵袭和转移.

目的 制备131I标记的抗神经纤毛蛋白(NPR)-2单克隆抗体(mAb)(131I-anti-NRP-2-mAb),在体内外观察其与NRP-2表达阳性肿瘤的结合特性,以探讨其应用于NRP-2表达阳性肿瘤显像的可能性.方法 (1)采用氯胺T法制备131 I-anti-NRP-2-mAb,经Sephadex G25柱纯化,用薄层色谱法测定放化纯和稳定性.(2)利用A549细胞进行体外实验,测定131I-anti-NRP-2-mAb的结合率和受体的亲和力.(3)将A549荷瘤裸鼠以随机抽样法随机分为4组,每组4只,分别于尾静脉注射0.37 MBq131 I-anti-NRP-2-mAb,6、24、48和72h后,测定并计算主要器官及组织的放射性摄取值[每克组织百分注射剂量率(％ID/g)]、肿瘤/肌肉放射性(T/M)比值和肿瘤/血液放射性(T/B)比值.(4)将A549荷瘤裸鼠以随机抽样法分为未阻断组和竞争性阻断组,每组3只,未阻断组经尾静脉注射3.7 MBq 131I-anti-NRP-2-mAb,竞争性阻断组经尾静脉注射同等剂量的标记物和100μg未标记的抗NRP-2 mAb,均分别于注射后6、24、48和72 h行γ显像,观察肿瘤放射性浓聚状况.采用两样本t检验分析数据.结果 (1)131 I-anti-NRP-2-mAb标记率为(94.69±3.63)％,放化纯为(98.56±0.48)％;室温下磷酸盐缓冲液中放置72 h,其标记率仍＞85％.(2) 131I-anti-NRP-2-mAb与A549细胞特异性结合率,在60、120、180和240 min时分别为(3.95±0.18)％、(5.19±0.65)％、(6.60±0.36)％和(5.58±0.63)％;加入过量未标记的anti-NRP-2-mAb后,下降至(0.94±0.31)％、(1.12±0.17)％、(1.24±0.25)％和(1.04±0.18)％,阻断组与未阻断组4个时间点细胞结合率间的差异具有统计学意义(t值:11.22、9.89、19.66和9.95,均P＜0.05);与A549细胞表面受体结合的半抑制浓度(IC50)值为(410.8±1.2) nmol/L.(3)注射131I-anti-NRP-2-mAb后,T/B比值和T/M比值均随着时间的延长逐渐增高,在72 h达到最高,分别为1.10±0.20和3.83±0.18.(4)γ显像示:未阻断组荷瘤鼠注射131I-anti-NRP-2-mAb后6h即可见肿瘤显影,48 h后肿瘤显像最清晰;竞争性阻断组荷瘤鼠在各时间点肿瘤均未见明显显影.结论 成功制备131I-anti-NRP-2-mAb,该标记物对NRP-2具有良好的靶向性.

目的 通过RNA干扰的方法确定最佳靶点用于NRP-1基因功能研究.在两株膀胱尿路上皮癌细胞中采用慢病毒干扰NRP-1基因表达,探讨NRP-1基因对膀胱尿路上皮癌细胞迁移和侵袭及血管新生能力的影响,为膀胱尿路上皮癌的发病机制,转移机制提供了理论基础.方法 采用Western Blot筛选出两株NRP-1表达丰度较高的细胞.设计NRP-1的RNA干扰靶点,构建干扰载体并包装至慢病毒载体中,通过qPCR和Western Blot筛选出能同时在上述两株细胞中有效干扰NRP-1的最佳靶点.分别感染两株膀胱尿路上皮癌细胞对照慢病毒和干扰NRP-1基因慢病毒载体,通过Transwell及血管新生法验证NRP-1对膀胱尿路上皮癌细胞的侵袭,转移和促进周围血管新生能力.结果 通过Transwell小室法发现,对照慢病毒感染的两株膀胱尿路上皮癌细胞体外的侵袭和迁移能力显著地高于NRP-1干扰慢病毒感染的细胞,NRP-1干扰对T24细胞的体外侵袭和迁移抑制率分别为51％和72％ (P ＜0.05),NRP-1干扰对5637细胞的体外侵袭和迁移抑制率分别为61％和65％(P＜0.05);通过血管新生实验发现,相较于对照病毒感染组,NRP-1干扰组两株膀胱尿路上皮癌细胞对血管内皮细胞的血管生成能力影响降低,干扰组对血管新生的调控能力下降率在T24和5637细胞中分别为21％和28％ (P ＜0.05).结论 NRP-1慢病毒RNA干扰对膀胱尿路上皮癌细胞的迁移和侵袭具有抑制能力,NRP-1干扰对膀胱尿路上皮癌细胞周围血管新生能力具有抑制能力.

免疫性血小板减少症(ITP)为一种获得性自身免疫性出血性疾病,该病以患者对自身抗原的免疫失耐受导致免疫介导的血小板破坏增多与生成不足为特征.近年来,研究发现调节性T细胞(Treg)、调节性B细胞(Breg)等免疫抑制性细胞亚群数量和(或)功能的异常,在ITP的发生、发展中发挥重要作用.阐明Treg、Breg与ITP发病的关系,有望为ITP的治疗提供新思路.因此,笔者拟就Treg与Breg的免疫调节机制,及其在ITP发病机制中的作用的研究进展进行综述.

目的 结肠癌的发生发展过程与肿瘤血管生成密切相关,神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肿瘤血管生成中发挥重要作用.本研究旨在探讨结肠癌组织NRP-1和VEGF表达及其预后的关系.方法 收集2010-08-01-2012-05-31南华大学附属南华医院普外胃肠病区手术切除、具有完整资料、术后经病理确诊的结肠癌及癌旁(＞5 cm)组织标本73例,采用免疫组织化学法检测NRP-1及VEGF在结肠癌及癌旁正常组织的表达;另外选取2016年南华大学附属南华医院切除结肠癌新鲜组织及癌旁组织(距癌组织＞5 cm)16对,采用蛋白质印迹法检测NRP-1及VEGF表达.结果 免疫组化结果显示,与结肠癌癌旁组织比较,结肠癌组织中NRP-1及VEGF呈高表达,x2=55.857,P＜0.001;x2=44.042,P＜0.001.蛋白质印迹法检测结果显示,新鲜结肠癌组织中NRP-1及VEGF蛋白呈高表达,而癌旁组织中表达降低,差异有统计学意义,t=-63.238,P＜0.001;t=-78.712,P＜0.001.结肠癌组织中NRP-1和VEGF高表达均与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结有无转移有关联,差异有统计学意义,P＜0.05;癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的数值与NRP-1表达有关联(x2=15.966,P=0.002),而与VEGF表达无统计学意义的关联,x2=0.061,P=0.862;Cox多因素回归分析显示,CEA(RR=4.851,95％CI:1.013～23.427)、肿瘤大小(RR=0.157,95％CI.0.017～1.228)、TNM分期(RR=5.419,95％ CI:2.179～32.479)、淋巴结转移(RR=0.137,95％CI:0.023～0.728)是NRP-1阳性表达的独立影响因素;生存分析显示,NRP-1阳性表达组患者生存周期短于阴性患者,x2=5.081,P=0.029.结论 NRP-1参与结肠癌的血管生成,并导致预后不良,提示NRP-1在结肠癌发生发展中起重要作用,为评估结肠癌预后及研究靶向药物提供新的思路.

目的 探究肝性脑病(HE)大鼠大脑前额叶皮层、海马CA1、CA3、DG区中脑信号蛋白3A(Sema3A)及受体神经菌毛素(NRP-1)的表达变化及可能的意义.方法 SD大鼠40只随机分为4组:对照组、HE1 d、15 d、30 d组,每组各10只.胆管结扎并辅以乙酸铵灌胃的方法 制备慢性HE(C型)大鼠模型,进行行为学、神经病学改变的检测;ELISA检测大鼠血清中血氨及其他生化指标;HE染色观察大鼠肝脏和脑组织形态学变化;Real-time PCR检测各脑区Sema3A、NRP-1 mRNA的表达;免疫组化、Western Blot分别检测大脑皮层、海马CA1、CA3、DG区中Sema3A及NRP-1蛋白的表达变化.计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验.结果 4组间神经反射等级、血氨、HE等级均有统计学差异(F值分别为76.39、417.07、71.56,P值均<0.001),与对照组比较,HE 1 d、15 d、30 d组神经反射得分、血氨、HE等级均明显升高(P值均<0.05).4组间TBA、Alb、TBil、AST、ALT、ALP比较差异均有统计学意义(F值分别为1022.61、171.56、685.18、421.01、675.20、2405.04,P值均<0.001),与对照组相比,HE 1 d、15 d、30 d组Alb水平明显降低(P<0.05),其余指标明显升高(P值均<0.05).病理学结果 显示,与对照组相比,造模后大鼠肝脏出现不同程度的变性坏死,炎细胞浸润,大脑前额叶皮层及海马CA1、CA3、DG区体等部位观察到神经细胞不同程度的肿胀、破裂、排列紊乱等病理征象.4组间Sema3A、NRP-1 mRNA比较差异均有统计学意义(Sema3A mRNA:F值分别为273.83、158.84、103.59、128.90,P值均<0.001;mRNA:F值分别为88.78、173.02、156.44、289.09,P值均<0.001);与对照组比较,HE 1 d、15 d、30 d组大脑前额叶皮层、海马CA1、CA3、DG区中Sema3A、NRP-1 mRNA相对表达量均较高(P值均<0.05).建模后Sema3A、NRP-1蛋白表达水平上调,免疫组化显示,HE组大鼠前额叶皮层和海马CA1、CA3、DG区Sema3A及NRP-1呈阳性染色.Western Blot显示,4组间大脑前额叶皮层及海马CA1、CA3、DG区Sema3A、NRP-1蛋白表达差异均有统计学意义(Sema3A:F值分别为835.14、774.16、282.60、856.29,P值均<0.001;NRP-1:F值分别为876.59、472.48、402.36、207.47,P值均<0.001);与对照组相比较,HE 1 d、15 d、30 d组大脑前额叶皮层及海马CA1、CA3、DG区内Sema3A、NRP-1蛋白表达均明显升高(P值均<0.05).结论 Sema3/NRP-1在慢性HE大鼠脑组织内表达上调,参与HE神经损伤的病理生理过程.