目的:分析肺炎链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶StkP胞外区(EC-StkP)基序(motif)在与β-内酰胺类抗生素结合中的作用。方法:分别将EC-StkP的3个motif(SXXK)依次和全部突变为AXXA，将突变后得到的质粒导入受体细胞进行克隆表达，SDS-PAGE联合凝胶图像分析系统检查目的重组突变蛋白(EC-rStkP)表达情况，Ni-NTA亲和层析法分别提纯突变蛋白。采用等温滴定量热法(ITC 200)和表面等离子共振法(Biacore t200)检测突变蛋白与青霉素(PCN)和头孢噻肟(CTX)结合能力。结果:PCN和CTX均不能与第1个、第3个以及3个motif均突变的蛋白质结合，但第2个motif突变后还能与CTX有较弱结合，而与PCN却不能结合。结论:肺炎链球菌StkP激酶胞外区的3个motif都能与β-内酰胺类抗生素结合，且以与第1个motif和第3个motif结合为主。

目的:探讨组氨酸激酶AgrC在亚抑菌浓度环丙沙星促进金黄色葡萄球菌生物膜形成中的作用机制，为金黄色葡萄球菌生物膜相关感染的治疗提供新的思路。方法:于2021年中南大学湘雅三医院检验科收集皮肤组织和体液标本，采用微量肉汤稀释法测定环丙沙星对实验菌株的最低抑菌浓度；采用结晶紫染色法观察不同亚抑菌浓度环丙沙星处理金黄色葡萄球菌后的生物膜形成情况；利用SYTO9和PI荧光染料分析亚抑菌浓度环丙沙星对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响；通过逆转录荧光定量PCR检测亚抑菌浓度环丙沙星对金黄色葡萄球菌 agrC基因及其调控基因 agrA、 icaA和 icaR的表达水平的影响；最后，通过等温滴定量热法验证亚抑菌浓度环丙沙星与AgrC蛋白受体的结合作用；数据采用 xˉ±s表示，服从正态分布和方差齐性则采用方差分析，否则采用非参数检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。 结果:药敏试验结果显示环丙沙星对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.25~0.5 mg/L。亚抑菌浓度的环丙沙星可促进金黄色葡萄球菌生物膜的形成，在1/4倍最低抑菌浓度即可开始出现显著作用［ATCC 43 300（ t=7.42， P=0.002）、临床菌株SA1（ t=5.42， P=0.005）、SA2（ t=6.38， P=0.002）、SA3（ t=4.8， P=0.009）、SA4（ t=7.06， P=0.002）和SA5（ t=4.36， P=0.004）］。激光共聚焦显微镜观察发现亚抑菌浓度的环丙沙星可明显促进金黄色葡萄球菌生物膜的形成，增加生物膜的形成量并使生物膜显著聚集成三维立体结构。逆转录荧光定量PCR结果显示，亚抑菌浓度的环丙沙星对 agrC基因表达水平无显著影响，但使agr A（ t=4.42， P=0.003）和 icaR（ t=4.49， P=0.007）表达水平下降［（0.61±0.24）和（0.56±0.12）］， icaA表达水平升高［1.51±0.19（ t=5.24， P=0.009）］，差异有统计学意义。等温滴定量热法分析发现，环丙沙星与AgrC蛋白受体具有较好的结合力。 结论:亚抑菌浓度环丙沙星可能通过结合AgrC蛋白受体，影响下游a grA、 icaA和 icaR基因表达水平，从而促进生物膜形成，增加金黄色葡萄球菌的抗菌药物耐药性。

目的:确定肺炎链球菌β-内酰胺抗生素耐药相关胞内应答调节蛋白CiaR能与跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶StkP结合组成StkP/CiaR二元信号传导系统(TCSS)。方法:采用PCR扩增 stkP基因胞内区片段(IC- stkP)，T-A克隆测序确认序列正确后构建其原核表达系统。SDS-PAGE检查IC- stkP片段和我们以往构建的 ciaR基因原核表达系统目的重组蛋白rIC-StkP和rCiaR表达情况，Ni-NTA亲和层析法提纯rIC-StkP和rCiaR。采用Co-IP和LC-MS/MS鉴定rIC-StkP捕获的肺炎链球菌靶蛋白。采用等离子共振法(SPR)和等温滴定量热法(ITC)检测rCiaR与rIC-StkP结合能力。 结果:所构建的IC- stkP片段原核表达系统能有效表达rIC-StkP。SDS-PAGE结果显示提纯的rIC-StkP和rCiaR在胶上均为单一蛋白质条带。CiaR可与rIC-StkP特异性共沉淀，其3个裂解肽位于CiaR分子内且序列完全相符。SPR和ITC结果显示，rCiaR与rIC-StkP呈高亲和力强结合，其 KD值分别为1.526×10 －9 mol/L和1.980×10 －6 mol/L。 结论:肺炎链球菌CiaR可作为StkP激酶下游应答调节蛋白组成StkP/CiaR-TCSS。

目的:探讨神经纤维瘤蛋白1（NF1）在胆囊癌中的机制。方法:采用实验研究方法。培养人胆囊癌细胞系GBC-SD、NOZ、SGC996、EH-GB1、ZJU0428，人胚肾细胞系293T，人宫颈癌细胞系HELA；构建免疫共沉淀实验所需的重组质粒mRFP-YAP1 FL-FLAG和eGFP-MYC-NF1 2650~2750-HA，体外纯化Yes相关蛋白1（YAP1）截断体蛋白和NF1融合蛋白。分别采用等温滴定量热实验、GST pull-down实验、免疫共沉淀实验、免疫荧光和激光共聚焦检测NF1与YAP1的体内外相互作用，采用蛋白质免疫印迹法检测不同胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平。观察指标：（1）NF1与YAP1的体外相互作用。（2）NF1与YAP1的细胞内相互作用。（3）不同人胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平。结合解离常数由ITC200等温滴定量热仪自带软件输出，以 x±s表示。计数资料以绝对值表示。 结果:（1）NF1与YAP1的体外相互作用。①等温滴定量热实验结果显示：PPQY肽段滴定体外纯化YAP1的第1个WW1结构域蛋白存在相互作用，结合解离常数为（0.42±0.06）mmol/L；PPQY肽段滴定体外纯化YAP1的162~275蛋白区段存在相互作用，结合解离常数为（0.69±0.14）mmol/L。②GST pull-down实验结果显示：相对于GST蛋白和His-Sumo-YAP1 WW1反应体系，在GST-PPQY融合蛋白与His-Sumo-YAP1 WW1反应体系的蛋白泳道中可以观察到目的蛋白His-Sumo-YAP1 WW1；相对于GST蛋白和His-Sumo-YAP1 WW2反应体系，在GST-PPQY融合蛋白与His-Sumo-YAP1 WW2反应体系的蛋白泳道中可以观察到目的蛋白His-Sumo-YAP1 WW2。（2）NF1与YAP1的细胞内相互作用。①免疫共沉淀实验结果显示：在使用FLAG凝胶珠孵育共转染mRFP-YAP1 FL-FLAG和eGFP-MYC-NF1 2650~2750-HA的细胞裂解液中，观察到NF1蛋白的免疫印迹。②免疫荧光和激光共聚焦检测结果显示：在人胆囊癌细胞系NOZ的原位荧光中，YAP1和NF1荧光明显，主要定位于细胞质中。在人胆囊癌细胞系SGC996的原位荧光中，YAP1荧光明显，主要定位于细胞核中，NF1荧光不明显。（3）不同人胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平。蛋白印迹实验结果显示：以人宫颈癌细胞系HELA中NF1蛋白的表达量为标准，在人胆囊癌细胞系EH-GB1、GBC-SD、NOZ、SGC996、ZJU0428中，NF1蛋白的相对表达量分别为1.28、0、1.01、0、0。 结论:NF1可能通过直接作用于YAP1蛋白影响胆囊癌。

目的·构建用于发现小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)的活化酶亚基1(SUMO-activating enzyme subunit 1,SAE1)与亚基2(SUMO-activating enzyme subunit 2,SAE2)相互作用的肽抑制剂的多种体外筛选体系,并对不同筛选体系的优势与不足进行评价.方法·将编码SAE1和SAE2的目的基因分别插入pET-28a载体以构造原核蛋白表达质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化人源SAE1和SAE2蛋白;利用纯化的蛋白先后构建等温滴定量热检测(isothermal titration calorimetry,ITC)实验、荧光偏振(fluorescence polarization,FP)实验、表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)实验和基于SAE酶活的荧光实验等多种筛选体系.尝试利用不同的筛选体系检测候选多肽的抑制活性,基于检测结果,从灵敏度、稳定性、检测通量和检测成本等维度评价各筛选体系的优缺点与适用性.结果·经ITC测得SAE1和SAE2蛋白在体外相互作用的解离常数(Kd)为0.96 μmol/L,并将活性最好的多肽PEPT7改造为FP实验的示踪剂(tracer),但同SAE2的亲和力无法满足FP的要求;SPR测得SAE1和SAE2相互作用的Kd值为1.13 μmol/L,与ITC数据接近;基于SAE酶活的荧光实验筛选得到抑制活性最强的多肽HP1B[半数抑制浓度(half-maximal inhibitory concentration,IC50)达15.72 μmol/L],SPR进一步确定其同SAE1的亲和力为34.4 μmol/L.结论·尝试构建并比较了多种常见的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)抑制剂的筛选体系.其中,ITC的检测通量低,且难以准确评估结合热不显著的低亲和力多肽;FP体系的可行性高度依赖于示踪剂同靶点蛋白之间的强亲和力,同样无法用于低亲和力多肽的筛选与优化;SPR检测的灵敏度高,但检测成本较高;酶活实验兼具高灵敏度、稳健性、高通量和可接受的检测成本,是最适宜的筛选方法.

目的:筛选并验证gasdermin D(GSDMD)单域抗体(single-domain antibody,sdAb)及其生物学功能.方法:利用原位邻近连接分析(in situ proximity ligation assay,isPLA)结合高通量测序筛选抗GSDMD sdAbs候选序列;利用isPLA、Co-IP、GST pull down、等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)验证这些sdAbs与GSDMD的特异性结合;在脂多糖(LPS)和nigericin处理的细胞焦亡模型中,观察细胞表型变化;检测细胞上清液中白细胞介素 1-β(IL-1β)水平变化以及乳酸脱氢酶(LDH)的释放;通过Western印迹检测经上述处理后的细胞中GSDMD以及GSDMD N端结构域(GSDMD N terminus,GSDMD-NT)量的变化.结果:通过isPLA结合高通量测序方法筛选出GSDMD sdAb的候选序列,其中sdAb#26 与GSDMD C端结构域(GSDMD C terminus,GSDMD-CT)相互作用;与sdAb Con对照组相比,sdAb#26 处理高表达GSDMD细胞产生焦亡表型的细胞显著增多;细胞上清中释放的IL-1β以及LDH显著提高(t=68.54,P<0.001;t=5.909,P<0.01);GSDMD-NT产生量显著增加.结论:GSDMD sdAb具备操控GSDMD介导焦亡的潜力,为焦亡相关疾病的治疗提供了新思路.

黄芩黄连药对水煎自沉淀现象已被广泛关注,产生自沉淀现象的本质是药对中酸碱性活性成分相互作用形成难溶性分子复合物,本试验设计基于中药配伍后有效成分间的相互作用,探索将等温滴定量热技术(isothermal titration calorimetry,ITC)应用于表征黄芩药材质量的可行性,建立以活性成分群为指标衡量药材质量的新方法.以不同批次黄芩药材(包括市售的3批黄芩药材和市场上常用做以次充好的黄芩苗)作为研究对象,应用ITC分别测定黄连中代表性功效成分小檗碱(2.5mmol·L-1)与不同批次黄芩水煎液间相互作用能量值,将小檗碱滴定空白水溶液的能量变化(2.51 μJ)作为空白对照,结果显示以小檗碱为标准物质,滴定不同批次黄芩水煎液中黄芩苷类成分的热量变化由高到低依次为黄芩A(-317.20 μJ)、黄芩B(-292.83 μJ)、黄芩C(-208.95 μJ)、黄芩苗(-21.53 μJ).其中小檗碱滴定黄芩苗的热量变化显著低于3批黄芩药材.应用紫外分光光度法以黄芩苷计测定不同批次黄芩水煎液在最大吸收波长处的吸光度值.紫外测定结果显示,相同稀释条件的不同批次药材吸光度由高到低依次为黄芩A(0.372)、黄芩B(0.333)、黄芩C(0.272)、黄芩苗(0.124),且黄芩苗吸光度显著低于前三组.ITC滴定与紫外测定结果相吻合,证明ITC能用于表征黄芩药材质量,基于ITC建立的以一类活性成分为指标评价黄芩药材质量的方法是简便、科学且可行的,此试验为构建更加全面、系统地表征药材质量提供了新思路.

酶分子在长期进化过程中形成一系列氨基酸残基组成的活性架构,参与底物的识别、结合与催化过程,而活性架构中相应氨基酸残基是如何影响酶分子结合底物的能力,进而影响酶分子的催化效率,一直是酶分子理性改造研究的热点.利用亲和电泳技术,可以快速展示内切纤维素酶TrCel12A和木聚糖酶TlXynA活性架构中不同突变体的催化活性及其迁移率的变化,进而通过在不同底物浓度凝胶中蛋白质相对迁移率变化程度的定量回归分析,发现由氨基酸单点突变导致蛋白质迁移率的相对变化,可以定量表征酶分子突变前后结合底物能力的变化.亲和电泳测定的有效阻滞常数Kb值与等温滴定量热法和荧光光谱法测定的相关参数比较具有明显相关性.由于亲和电泳技术在测定酶分子与底物的结合能力时具有简便、快速、灵敏的特点,因而可作为常规生化实验室常规普筛技术来检测突变文库中系列突变体导致结合力的变化.

[背景]在鼠伤寒沙门氏菌中,c-di-GMP结合蛋白YcgR通过与鞭毛运动蛋白的相互作用,抑制鞭毛运动速度,使细菌由浮游生长向生物膜产生及侵染宿主的静止状态转变.然而,目前关于该蛋白的结构、功能以及与c-di-GMP结合后调控细菌运动状态的分子机制还不清楚.[目的]通过原核表达,获得高纯度的YcgR蛋白,并对其二级结构稳定性以及c-di-GMP结合活性进行表征,为进一步确定YcgR的结构以及阐明c-di-GMP如何通过结合YcgR而减缓细菌运动速度的分子机制奠定基础.[方法]通过构建重组大肠肝菌对YcgR进行原核表达;通过Ni-NTA镍离子亲和层析柱和体积排阻色谱两步纯化获得高纯度的YcgR蛋白;预测YcgR蛋白质结构,利用圆二色光谱仪(CD)测定其二级结构;通过等温滴定量热法(ITC)和热转移技术(Protein thermal shift)研究YcgR与c-di-GMP的结合活性.[结果]菌落PCR和质粒测序结果表明,表达YcgR的重组大肠杆菌构建成功;SDS-PAGE和体积排阻色谱显示YcgR的分子量大约为28 kD,在溶液中以二聚体的形式存在;通过预测和对比,发现YcgR的结构与同源蛋白PP4396高度相似,都有一个响应c-di-GMP的PilZ结构域,且CD结果显示YcgR具有稳定的二级结构;ITC和Thermal Shift结果表明,YcgR与c-di-GMP有较强的结合活性,其Kd值为50nmol/L.[结论]首次实现了鼠伤寒沙门氏菌YcgR蛋白的原核表达及纯化,表征了其c-di-GMP结合活性,为进一步研究YcgR蛋白与细菌信号分子c-di-GMP调控鞭毛运动的分子机制奠定基础,并为鼠伤寒沙门氏菌抗感染药物的研发和治疗提供新的策略.

目的 探讨乙醇脱氢核酶ribox02与NAD+、NADH特异性结合的位点以及结合力性质.方法 通过选择性2-OH酰基化学探测法(selective 2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,SHAPE)探测ribox02的二级结构;利用等温滴定量热法(isothermal titratio calorimetry,ITC)进一步测定ribox02与NADH、NAD+的亲和力强度及作用力性质;通过紫外交联法精确定位NAD+、NADH与ribox02 RNA的特异性结合位点.结果 直接解析ribox02的二级结构,并发现核酶ribox02与NADH、NAD+的相互作用力为范德华力或氢键作用,且ribox02与NADH的相互作用力较之与NAD+更为强烈,ribox02与NADH、NAD+的特异性结合位点为23G、24U、25U、38U、72U、73U、74U、75G和95G.结论 通过ribox02的二级结构及其与NAD+、NADH的相互作用揭示了核酶ribox02与NAD+/NADH特异性结合位点以及结合力性质.