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多色荧光探针的滚环扩增技术检测结核分枝杆菌耐药基因
编辑人员丨1周前
本研究旨在构建基于核酸滚环扩增(RCA)的简便快速、超灵敏的光学生物传感技术,并将其运用于结核杆菌耐药相关基因的多重检测。本研究在2020年2月至2021年5月期间,于陆军军医大学第一附属医院检验科,针对异烟肼、利福平和链霉素耐药的高频基因突变位点katG315(AGC?ACC)、rpoB531(CAC?TAC)和rpsL43(AAG?AGG),分别设计锁式探针(padlock probe,PLP)、引物和捕获探针,构建了基于磁珠的固相RCA恒温扩增反应体系,并进行了实验参数的优化。通过多色荧光探针(Cy3/Cy5/ROX)对RCA产物精准捕获与信号放大,实现了对3种突变基因的单管多重检测。进一步对该方法的灵敏度、特异性与线性范围等分析性能进行验证,结果显示同一反应体系中katG315的响应范围为1.0 pmol/L至0.1 nmol/L,rpoB531和rpsL43的响应范围为1.0 pmol/L至50.0 pmol/L和1.0 pmol/L至20.0 pmol/L,且该方法具有较好的特异度与灵敏度,在混合靶标中可精确识别单碱基突变,最低检出限低至1.0 pmol/L;在模拟血清样本的回收实验中,回收率可达95.0%~105.2%。综上,本研究构建的恒温扩增型多重检测方法可快速实现3种耐药突变位点的单管多重检测,该技术成本低廉、简便快速、不依赖大型设备,为病原体耐药基因检测提供了一种新的分析方法。
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编辑人员丨1周前
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临床结核病病原体分子生物学诊断年度进展2022
编辑人员丨1周前
结核病仍然是威胁人类健康的全球公共卫生问题,快速准确的病原体检测是实现早期诊断和有效治疗的关键。近年来,结核病的病原学诊断由传统的细菌学诊断向分子诊断扩展。近1年,具有良好诊断性能的Xper MTB/RIF Ultra技术更多被应用于非呼吸道样本的检测,Xpert XDR和二代线性探针技术为MDR-TB的早期快速准确诊断提供了更多依据;基因组测序技术也被更多开发应用于非培养物样本的检测,其检测成本和所需时间已相对降低和减少;更适合初级医疗保健中心开展的Truenat技术被更广泛应用;游离DNA检测及质谱检测等新型结核病检测技术同样不断发展,有望成为结核病及耐药结核病早期快速诊断的重要手段。本文综合2021年10月1日至2022年9月30日国内外结核病病原体分子生物学诊断的重要进展成果,评估分子生物学检测技术的优缺点及应用现状,为临床选择和应用提供重要依据。
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编辑人员丨1周前
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唑尼沙胺对创伤性脑损伤糖氧剥夺细胞模型的保护作用及机制研究
编辑人员丨1周前
目的:探讨唑尼沙胺(zonisamide, ZNS)对创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)细胞模型的保护作用及其机制。方法:体外培养人神经母细胞瘤(human neuroblastoma cells, SH-SY5Y)细胞,按随机数字表法分为对照组(Control组)、糖氧剥夺组(OGD组)和给药组(OGD+ZNS组)。采用糖氧剥夺法建立创伤性脑损伤细胞模型。造模后,检测细胞活性;检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放情况;β-半乳糖苷酶试剂盒对细胞染色,观察细胞衰老情况;线粒体红色荧光探针(Mito Tracker Red)、JC-1线粒体膜电位试剂盒对线粒体染色,观察线粒体形态及膜电位变化;检测细胞ATP浓度;从SH-SY5Y细胞中提取蛋白,用蛋白质印迹法(Western blot)法检测内质网应激相关指标:葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78),增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP-homologous protein antibody,CHOP)、蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)以及内参β-肌动蛋白(β-actin)的表达变化。结果:OGD组细胞存活率较Control组明显减少( P<0.01),OGD+ZNS组细胞存活率较OGD组明显增加( P<0.01);OGD组LDH释放率较Control组明显增加( P<0.01),OGD+ZNS组LDH释放率较OGD组明显减少( P<0.01)。细胞染色结果显示,与Control组和OGD+ZNS组相比,OGD组细胞明显受损衰老严重,染色更深。线粒体染色结果显示,与Control组和OGD+ZNS组相比,OGD组线粒体线性连接明显减少,线粒体活性明显下降。与Control组和OGD+ZNS组相比,OGD组细胞线粒体染色红色荧光明显减弱,绿色荧光明显增强,线粒体膜电位明显下降;OGD组ATP浓度较Control组明显下降( P<0.01),OGD+ZNS组ATP浓度较OGD组明显上升( P<0.01)。Western blot结果显示OGD组GRP78、CHOP、PDI表达较Control组明显增加( P均<0.05),OGD+ZNS组GRP78、CHOP、PDI较OGD组明显下降( P均<0.05)。 结论:唑尼沙胺可以通过保护线粒体活性以及抑制内质网应激保护创伤性脑损伤糖氧剥夺细胞模型。
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编辑人员丨1周前
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双相障碍外周血RNA测序数据的随机森林与前馈神经网络联合判别模型的构建与分析
编辑人员丨1周前
目的:通过随机森林方法寻找双相障碍特征基因,并利用神经网络方法构建双相障碍诊断判别模型。方法:选用GSE23848数据集中双相障碍( n=20)与健康对照者( n=15)的基因表达数据,使用阴性对照探针进行背景校正,并使用阴性和阳性对照探针进行标准化,线性模型分析和经验贝叶斯统计方法识别差异表达基因。构建随机森林模型对差异表达基因进行特征提取及构建神经网络模型,在独立外部GSE39653数据集[双相障碍患者( n=8)和健康对照者( n=24)]中验证模型的判别效能。通过基因本体论(gene ontology,GO)、蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction networks,PPI)等方法对特征基因进行生物学功能探索。 结果:共筛选出1 330个与双相障碍相关的差异表达基因以及35个特征基因进行模型构建。最终得到了一个包含4个隐藏层与4个丢弃层,具有50 433个可训练参数的前馈神经网络模型。在外部验证集中使用自助法(bootstrap)经过1 000次重复抽样计算其敏感度、特异度、受试者工作特征(receiver operation characteristic,ROC)曲线下面积、准确度的可信区间均为1,在GSE39653外部验证集中,模型的ROC曲线下面积(area under curve,AUC)值为0.72。对特征基因的富集分析表明模型中基因的功能与线粒体结构及能量代谢相关。结论:随机森林方法可以识别双相障碍的特征基因,随机森林与前馈神经网络联合建立的诊断模型在双相障碍中具有较好的分类性能。
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编辑人员丨1周前
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SARS-CoV-2 Omicron变异株TaqMan探针法荧光定量RT-PCR的建立及应用
编辑人员丨1周前
目的:开发和评估一种快速、简单和经济的替代测序的Omicron变异株荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)。方法:针对SARS-CoV-2 ORF1ab保守区域、Omicron变异株S基因高频共同突变位点设计引物和TaqMan探针,建立Omicron株RT-qPCR检测方法,用经全基因组测序确定型别的样本进行验证,并对该方法的特异度和敏感度进行评估。结果:本研究建立的RT-qPCR分型法可以将Omicron变异株与包括早期A型流行株、Alpha和Delta变异株在内的SARS-CoV-2毒株进行区分,结果与全基因组测序结果一致,符合率为100.00%(28/28);与其他6种呼吸道病毒及柯萨奇病毒A组16型无交叉反应;该方法RNA标准品在10 9~10 3拷贝/μl之间呈良好的线性关系,相关系数 R2均大于0.99,检测敏感度为10 3拷贝/μl。 结论:本研究设计的针对Omicron变异株的RT-qPCR敏感度高且特异度好,在任何可以进行PCR检测的实验室中都容易开展,可极大地促进对Omicron变异株的传播监测。
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编辑人员丨1周前
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宏基因二代测序技术检测多瘤病毒在尿路感染中的临床应用
编辑人员丨1周前
目的:探讨宏基因二代测序技术检测尿路感染患者尿液中多瘤病毒的临床价值。方法:2018年9月至2020年4月复旦大学附属中山医院收治的送检尿液宏基因二代测序的尿路感染患者共33例。采用随机扩增法、脱氧核糖核酸纳米球、华大基因公司BGI-500测序平台及BWA算法为基础的比对法等技术对尿液标本的核酸提取物进行二代测序分析,以尿标本中多瘤病毒核酸序列数>100为入选标准,分析检出多瘤病毒的类型、深度、覆盖度、丰度及序列数等参数。采用Taq Man探针实时定量聚合酶链反应(PCR)法验证并检测多瘤病毒DNA载量。结果:30.3%(10/33)的患者尿标本中检出JC多瘤病毒,其中1例合并检出BK多瘤病毒。所有患者在检测前均使用抗菌药物治疗,但仅一例尿培养阳性。JC多瘤病毒检出的深度均值为35.9,覆盖度均值96.8%,相对丰度均值92.6%,唯一比对序列数均值为3 154。实时定量PCR法检测10例患者尿中JC多瘤病毒DNA载量在5.84×10 3~6.55×10 8拷贝/ml,均值为6.82×10 7拷贝/ml,其中9例患者(均为免疫受损者)的病毒载量超过5×10 4拷贝/ml,与宏基因二代测序结果基本相符。每1 M数据中的严格比对序列数(RPM)与CD4 +T细胞计数存在线性负相关( R2=0.84, P=0.004)。其中1例患者经西多福韦治疗后症状及尿检指标好转,随访尿液宏基因二代测序检查JC多瘤病毒的序列数及RPM值明显下降,实时定量PCR法证实尿中病毒DNA载量亦下降。 结论:宏基因二代测序技术在病毒性尿路感染的诊断中有着重要意义。西多福韦可能是治疗多瘤病毒尿路感染的一个选择。
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编辑人员丨1周前
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重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)病毒颗粒数微滴式数字PCR方法的建立
编辑人员丨1周前
目的:构建一种重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)病毒颗粒数微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)检测方法。方法:以新型冠状病毒BA.1株基因组为靶基因,选取刺突蛋白保守序列设计引物和探针,建立重组新型冠状病毒疫苗病毒颗粒数ddPCR方法,并进行线性、准确度、专属性、重复性和耐用性等方法学验证。结果:ddPCR的最佳退火温度是63℃,病毒颗粒数为5×10 5~2×10 7 VP/ml时,线性和回收率良好,探针和引物特异性好,重复性和中间精密度变异系数(coefficient of variation,CV)都在10%以内,耐用性CV值在15%以内,并且与qPCR结果相比,CV值都在10%以内。 结论:本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、稳定性好、特异性强,可用于重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)病毒颗粒数的定量检测。
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编辑人员丨1周前
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建立基于适体-纳米金的比色生物传感器用于快速检测Lp-PLA2
编辑人员丨1周前
目的:筛选血管炎性标志物脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的DNA适体,并建立以非标记核酸适体-纳米金为探针的可视化检测方法。方法:方法学建立。通过磁珠固定SELEX技术经孵育结合、ssDNA分离、PCR扩增、单链回收的8轮循环筛选Lp-PLA2适体,利用表面等离子体共振技术和流式细胞术验证适体的亲和力和特异性,并通过计算机软件模拟适体二级结构及其与靶蛋白的三维分子对接。随后制备适体-纳米金复合物,利用靶标竞争结合导致纳米金溶液在盐诱导下凝聚引起颜色变化,分光光度计检测溶液的吸光度检测靶标浓度,建立样品溶液中Lp-PLA2浓度与吸光度的线性关系。结果:筛选获得3条高亲和力、强特异性的Lp-PLA2核酸适体B76-2、B76-4及B76-5,解离常数分别为1.07、1.26及1.75 nmol/L;并成功基于B76-2适体构建纳米金比色传感方法,其线性范围和检测限分别是20~500 ng/ml和78 ng/ml,反应时间30 min,可特异性区分靶标与其他血栓标志物如凝血酶和髓过氧化物酶。结论:利用核酸适体-纳米金显色实现了简单、快速、特异的Lp-PLA2可视化检测。
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编辑人员丨1周前
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慢性髓细胞性白血病BCR::ABL1基因p210转录本实验室自建荧光定量PCR检测方法的性能确认
编辑人员丨1周前
目的:建立BCR::ABL1 p210转录本荧光定量PCR(RQ-PCR)实验室自建检测方法和分析性能确认。方法:本研究采用欧洲抗癌计划(EAC)公布的BCR::ABL1 p210转录本RQ-PCR检测的引物和探针序列建立了BCR::ABL1 p210转录本RQ-PCR实验室自建检测(LDT)方法,通过WHO国际参考品获得转换系数(CF),并使用K562和HL60细胞系混合物构建两个不同水平的实验室内部质控品。回顾性分析慢性髓细胞性白细胞(CML)患者阳性标本,参考CLSI MM01-A3等指南评价实验室自建BCR::ABL1 p210 RQ-PCR 方法的精密度、正确度、线性范围、分析灵敏度和分析特异性等参数。采用Bland-Altman法对LDT方法与美国FDA批准的BCR::ABL1 p210转录本定量检测体外诊断(IVD)试剂盒检测结果进行一致性分析。结果:本中心通过WHO国际参考品校准获得的BCR::ABL1国际标准值(BCR::ABL1 IS)的CF为0.535。本研究建立的LDT方法在4个分子学反应(MR)水平(0.5、1.5、2.5、3.5)的BCR::ABL1 IS 的重复性变异系数( CV)分别为7.44%、5.33%、9.12%、18.06%,室内总不精密度 CV分别为7.99%、5.49%、10.95%、17.99%。2020至2022年本实验室所有美国病理学家协会(CAP)能力验证(PT)样本的MR值均在CAP允许的变异范围内,MR结果与CAP-PT MR 平均值强相关( r=0.999, P<0.01),所有差值均在一致性界限范围内。本研究建立的LDT方法与Qiagen IVD试剂盒检测结果相关性高( r=0.997, P<0.01)。e13a2转录本的BCR::ABL1 IS线性范围为0.001%~7.454%,最大 CV值为64.09%。e14a2转录本的BCR::ABL1 IS线性范围为0.002%~12.398%,最大 CV值为43.37%。e13a2转录本和e14a2转录本的最低检测限(LoD)分别为MR5.0(0.001% IS)和MR4.8(0.002% IS);e13a2和e14a2转录本定量检测限(LoQ)均为MR4.7(0.002% IS)。该方法分析特异性为100%,与BCR::ABL1 p190转录本检测无交叉反应性。 结论:本实验室自建的BCR::ABL1 p210转录本RQ-PCR定量检测体系分析性能良好,可满足CML患者BCR::ABL1融合基因的临床检测需求。
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编辑人员丨1周前
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不同基因型Prader-Willi综合征患者临床生化特征和治疗效果差异分析
编辑人员丨1周前
目的:分析不同基因型Prader-Willi综合征(PWS)患者临床生化特征和治疗效果的差异。方法:回顾性纳入2017年5月至2018年12月于北京协和医院内分泌科门诊就诊的35例PWS患者,其中男20例,女15例,年龄[ M( Q1, Q3)][3.0(0.8,10.0)]岁。收集患者的临床和生化资料,并采集外周血标本。提取患者外周血白细胞DNA,用甲基化特异性多重连接探针扩增技术(MS-MLPA)检测患者基因缺失或甲基化异常,并据此分组(父源缺失组27例,甲基化异常组8例),分析两组患者生化检查结果及生长激素的治疗效果。 结果:MS-MLPA技术检测示77%(27/35)的患者基因型为父源缺失型,23%(8/35)患者为甲基化异常。生化检查结果方面,父源缺失组患者尿酸(UA)水平高于甲基化异常组[(363±101)μmol/L比(259±74)μmol/L, P=0.019]。体重与尿酸水平之间存在线性关系,经体重校正后,父源缺失组与甲基化异常组患者尿酸水平差异无统计学意义( P=0.101)。两组患者均应用生长激素[剂量:每天(0.14±0.03)U/kg]治疗。父源缺失组患者随访(26.0±13.6)个月,身高由(99.0±31.5)cm[(-0.3±1.1)同年龄同性别儿童身高标准差(SDS)]增加至(107.5±27.0)cm[(0.7±0.9)SDS]( P=0.037);甲基化异常组患者随访(25.8±11.6)个月,患者身高由(86.4±31.2)cm[(-0.7±1.8)SDS]增加至(95.6±26.5)cm[(0.0±1.6)SDS]( P=0.557)。治疗前后父源缺失组和甲基化异常组患者体质指数差异无统计学意义[(22.0±7.1)kg/m 2比(22.4±6.8)kg/m 2, P=0.890;(17.0±3.1)kg/m 2比(16.4±2.7)kg/m 2, P=0.754]。 结论:父源缺失和甲基化异常的PWS患者生化检查结果差异无统计学意义。PWS患者早期应用生长激素治疗可有效促进身高增长,控制体重增加。
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编辑人员丨1周前
