目的:构建一种太赫兹（THz）超材料传感方法用于microRNA-21（miRNA-21）的信号放大检测。方法:首先构建THz超材料传感方法，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳及zeta电位验证方法的可行性；对传感器检测条件进行优化之后，对不同浓度的miRNA-21以及其他不同的miRNAs进行检测，并与其他microRNA检测方法进行比较；最后，对该传感器的回收率进行了评价。结果:在最优实验条件下，通过双链特异性核酸酶（DSN）循环识别与滚环扩增（RCA）的双重信号放大策略，该THz超材料传感器对靶标miRNA-21的响应范围为10 fmol/L至10 nmol/L，检测限为8.49 fmol/L。并且该传感器具有较好的特异性，具备了从多种miRNAs中识别靶标miRNA-21的能力，并且在商业化人血清样本中的回收率可达94.33%到115.33%。结论:该THz传感器可以实现靶标miRNA-21的高灵敏、高特异性检测，具备了在miRNA相关疾病无标记诊断与早期预警的潜力。

本研究旨在构建基于核酸滚环扩增（RCA）的简便快速、超灵敏的光学生物传感技术，并将其运用于结核杆菌耐药相关基因的多重检测。本研究在2020年2月至2021年5月期间，于陆军军医大学第一附属医院检验科，针对异烟肼、利福平和链霉素耐药的高频基因突变位点katG315（AGC?ACC）、rpoB531（CAC?TAC）和rpsL43（AAG?AGG），分别设计锁式探针（padlock probe，PLP）、引物和捕获探针，构建了基于磁珠的固相RCA恒温扩增反应体系，并进行了实验参数的优化。通过多色荧光探针（Cy3/Cy5/ROX）对RCA产物精准捕获与信号放大，实现了对3种突变基因的单管多重检测。进一步对该方法的灵敏度、特异性与线性范围等分析性能进行验证，结果显示同一反应体系中katG315的响应范围为1.0 pmol/L至0.1 nmol/L，rpoB531和rpsL43的响应范围为1.0 pmol/L至50.0 pmol/L和1.0 pmol/L至20.0 pmol/L，且该方法具有较好的特异度与灵敏度，在混合靶标中可精确识别单碱基突变，最低检出限低至1.0 pmol/L；在模拟血清样本的回收实验中，回收率可达95.0%~105.2%。综上，本研究构建的恒温扩增型多重检测方法可快速实现3种耐药突变位点的单管多重检测，该技术成本低廉、简便快速、不依赖大型设备，为病原体耐药基因检测提供了一种新的分析方法。

等温扩增技术是在恒温条件下进行扩增的一类新型核酸扩增技术。基于该技术建立的方法操作简便，且具有较高的灵敏度与特异性，在临床与科研等方面展现了较好的应用前景。本文就环介导等温扩增、交叉引物扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的等温扩增和滚环扩增等技术的原理、特点及应用进行了综述。

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关基因(Cas)系统是古菌和细菌适应性免疫系统,最初被发现用来进行基因编辑,近年其特异识别和切割特性以及可编程性使其在核酸和非核酸靶标检测中崭露头角.目前基于CRISPR/Cas系统的核酸检测系统主要与核酸扩增技术如PCR、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和EXPAR等恒温扩增技术结合,以提高灵敏度;多项研究也在尝试开发基于CRISPR/Cas的无预扩增核酸检测系统;另外也有研究尝试通过生物祖体(包括适体、DNAzymes和抗原-抗体反应)特异性识别靶物质实现非核酸信号转换为核酸信号,实现基于CRISPR/Cas的蛋白质、小分子、细胞等非核酸物质的检测.但仍存在一些挑战,其中目标中痕量原始浓度的信号转换和放大是分析系统的关键挑战;其他挑战包括CRISPR/Cas存在一定背景活性,CRISPR RNA和单链DNA/单链RNA信号报告序列有降解风险等.随着技术的逐渐成熟,CRISPR/Cas系统将在生物靶标检测中发挥更大作用.本文就CRISPR/Cas系统在核酸检测这一领域的最新发展方向作一述评.

目的 对重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者血浆染色体外环状DNA(extrachromosomal cir-cular DNA,eccDNA)进行全长测序,分析eccDNA的分子特征及潜在功能,初步探索eccDNA在MG发病过程中的作用机制.方法 收集2例MG患者及2例性别、年龄与之匹配的健康人血浆样本,基于滚环扩增和纳米孔测序全新技术平台,对血浆eccDNA进行全长测序,分析比较MG患者与健康人血浆eccDNA的长度分布、染色体来源、基因组元件分布及eccDNA相关差异基因功能富集情况.结果 在MG患者和健康对照者中,长度为250～500 bp的eccDNA均分布最多,且MG患者在150～300 bp之间eccDNA呈现另一分布高峰,对照组则在此区间的eccDNA丰度极低.健康对照组eccDNA在1号染色体上分布最多,而MG患者组eccDNA在2号染色体上分布最多;MG患者eccDNA来源基因组元件在内含子、远端基因间区占比均高于健康对照者,而外显子区占比均低于健康对照者.相较于健康对照组,MG患者组eccDNA差异基因富集的通路多与氯离子通道活性、氯离子跨膜转运、钙离子结合及细胞信号传导有关.结论 MG患者与健康人血浆eccDNA的分子特征(大小分布、染色体来源、基因组元件分布、eccDNA基因功能富集)存在差异,提示eccDNA可能通过基因表达调控、细胞信号传导、神经突触发育及免疫功能调节等潜在功能影响MG的发生发展,eccDNA可能成为MG早期诊断和疗效监测的新型生物标志物.

目的 建立检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增(RCA)方法.方法 以家兔血清中豆状囊尾蚴来源的novel-miR1为诊断靶标,设计连接序列和锁式探针,并对连接序列和锁式探针的比例、反应时间、酶用量、dNTP用量以及扩增反应时间等5个重要条件进行优化,建立检测豆状囊尾蚴感染的RCA方法.将novel-miR1标准品倍比稀释为1 fmol/L至100 nmol/L的9个不同浓度的样品,评价RCA方法的灵敏度.用优化后的RCA方法分别检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA各20份(实验室保存样品),并通过受试者工作特征(ROC)曲线分析其敏感性和特异性.20只雌性家兔每只经口感染1 000个豆状带绦虫虫卵,采集感染前和感染后每个月的家兔血样制备血清miRNA,用优化后的RCA方法进行检测,评价其应用效果.结果 电泳结果显示,RCA扩增产物的DNA停留在加样孔中,形成一条明亮条带.反应条件优化试验结果显示,连接序列浓度为2μmol/L、锁式探针浓度为1μmol/L(连接序列和锁式探针的比为2:1)、T4 DNA连接酶为350 U、连接180 min时连接效率最高.在100μl的扩增体系中,dNTP浓度为0.5 μmol/L,扩增240 min时,RCA扩增效果最佳.优化后RCA的最低检测浓度为10 pmoI/L.RCA检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA样品的平均荧光值分别为53.298±1.707和97.498±5.892,差异有统计学意义(t=7.206,P＜0.01).ROC分析结果显示,当阳性临界值为61.69时,RCA方法的敏感性和特异性均为95％,AUC为0.955 0,似然比为19.00.RCA检测豆状囊尾蚴感染后不同时间的家兔血清miRNA结果显示,20份感染前的血清中19份检测结果为阴性,1份为阳性;感染后1个月的血清中,17份为阳性,2份为疑似,1份为阴性;感染后2个月的血清,1份为阴性,其余为阳性;感染后3个月的血清,3份为阴性,其余为阳性.结论 建立了检测家兔豆状囊尾蚴感染的RCA方法,该方法在豆状囊尾蚴感染后3个月内的家兔血清中检出novel-miR1,具有良好的应用潜力..

近年来,食源性致病菌在全球范围内大面积传播,给人类的生存健康与发展带来了巨大的威胁.因此为了保证食品的安全,快速的、高特异性且高灵敏地检测食品致病菌方法已经成为科学研究的热点话题.在本研究中,我们构建了一种基于滚环扩增技术的纸基显色传感器用于可视化检测致病菌的检测平台.通过滚环扩增对单增李斯特菌的hlyA mRNA进行高效特异性扩增,扩增后的单链产物经过Hhal酶进行特异位点酶切后,形成与锁式探针长度相同的片段.将酶切后的单链产物不经过预变性杂交,可直接进行试纸条检测.在优化的实验条件下,可以检测到100 pg/μL总RNA.整个过程实验包括连接,扩增,酶切,检测等反应均可在恒温条件下进行,且可在几个小时内完成.这种方法适用于快速的现场检测,此外,这项研究强调了纸基显色诊断平台的潜在价值和应用前景.

[目的]获取哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列.[方法]应用差速离心以及滚环扩增的方法得到纯度较高的线粒体DNA,采用Illumina HiSeq X Ten技术对扩增得到的哈氏蜈蚣线粒体DNA进行测序,采用从头组装和mapping近缘种的方法拼接组装线粒体基因组,应用MITOS在线注释及与近缘种进行本地注释等方法注释线粒体基因组.[结果]获得14538 bp哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列.其共有20个tRNA及13个蛋白基因,2个rRNA(16S rRNA、12S rRNA).[结论]获取哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列,并可用于药用蜈蚣的资源调查与保护研究.

目的 观察HepG2.2.15细胞在不同浓度阿德福韦酯(ADV)持续诱导下发生经典耐药突变的情况,并探讨其产生耐药的机制.方法 用不含或含0.01、0.1、1.0μmol/L ADV的培养基于12孔板中培养HepG2.2.15细胞,每3d传代,共培养至110代,分别抽提细胞和上清中的HBV DNA,每10代取样1次.以不降解质粒的ATP依赖性DNA酶消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法和单管巢式PCR方法分别扩增细胞内HBV cccDNA和上清中HBV DNA的反转录酶(RT)区.以PCR产物直接测序结合克隆测序法(20个克隆/样本)分析细胞内HBV cccDNA和上清HBV DNA的RT区是否产生经典ADV耐药突变.结果 未经药物处理的对照组持续稳定表达HBV DNA.0.01 μmol/L ADV组和0.1 μmol/L ADV组随着ADV干预时间的延长,细胞内总HBV DNA、cccDNA及上清中HBV DNA的载量持续下降.0.01 μmol/L ADV组细胞内和上清中至110代仍未检测出耐药变异,0.1μmol/L ADV组细胞内和上清中在110代时检测到RT区发生rtA181V+N236T变异.1.0 μmol/L ADV组由于细胞生长受到抑制于第15代时停止培养.结论 HepG2.2.15细胞内存在HBV cccDNA循环池,用含适量浓度ADV的培养基持续培养可以诱导HepG2.2.15细胞发生经典耐药突变.

目的 探索乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV) G588C突变在原发性肝细胞癌(HCC)组织HBV cccDNA中的存在情况及其对HBV复制的影响. 方法 通过滚环扩增(rolling cycle amplification,RCA)和PCR扩增测序,寻找G588C突变在18对HCC患者癌与癌旁组织中的存在情况.在HBV 1.2×质粒(HBV C基因型)的基础上构建G588C突变位点,将G588C突变质粒与野生型质粒分别转染HepG2和Huh7肝癌细胞系细胞,检测上清和细胞中HBsAg含量及上清中HBV DNA水平. 结果 在18对癌与癌旁组织中G588C、突变只存在于3例癌组织中;G588C突变组上清中HBsAg 3、4d含量分别为HepG2细胞5.605±1.182,8.270±2.241,Huh细胞2.714±0.371,10.148±2.793,细胞内HBsAg 3、4d含量分别为HepG2细胞4.852±1.024,7.736±1.762,Huh细胞18.349±3.040,34.110±2.129;野生型组上清中HBsAg 3、4d含量分别为HepG2细胞8.083±1.428,13.170±0.938,Huh细胞6.231±0.373,23.971±1.573,细胞内HBsAg 3、4d含量分别为HepG2细胞2.937±0.876,4.270±1.659,Huh细胞13.498±3.06,21.010±3.488.G588C突变组上清中HBsAg含量显著低于野生型组(F=44.88,P＜0.01),G588C突变组细胞内HBsAg含量显著高于野生型组(F=34.65,P＜0.01);G588C突变组上清和细胞中HBs Ag总量与HBV 1.2×野生型组比较差异无统计学意义(F=7.69,P＞0.05);G588C突变组上清中HBsAg与细胞内HBsAg的比值显著低于HBV 1.2×野生型组(F=23.59,P＜0.05),HBV DNA水平与两组间差异无统计学意义(F=6.23,P＞0.05). 结论 G588C突变不影响HBV的复制,但影响HBsAg由细胞内向细胞外的分泌,这可能与HCC的发生发展有关.