目的 通过无血清悬浮驯化CHO-K1细胞,筛选出单克隆源性可追溯、生长状态良好的宿主细胞株,并进行表达验证.方法 采用逐步降低血清含量的方法,将贴壁状态的CHO-K1细胞驯化成适应无血清培养基培养的悬浮细胞;通过单细胞接种/成像系统Verified In-Situ Plate Seeding(简称VIPS系统)筛选单克隆,经连续培养综合评估单克隆细胞的倍增时间、结团率、细胞直径等参数,确定候选克隆;将候选克隆分别转染携带绿色及红色荧光蛋白的质粒,根据荧光蛋白表达情况确定1株克隆作为工程细胞株的宿主细胞.结果 驯化获得的CHO-K1细胞适应无血清悬浮培养,倍增时间为20～24 h;通过单克隆筛选和产量评估确定的单克隆细胞株单克隆源性良好且可追溯,以0.5 × 106个/mL的细胞密度接种,培养7 d最高细胞密度可达8.27 × 106个/mL,活率不低于80％,平均倍增时间20.31h,能较好地表达外源基因.结论 通过无血清驯化培养,成功获得单克隆源性可追溯、生长状态良好且能够用于蛋白高表达的CHO-K1细胞株.

目的 将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养,建立悬浮细胞系,并进行检定,以期为细胞基质流感疫苗的研发奠定基础.方法 采用摇床适应法将贴壁培养的MDCK(NBL-2)细胞驯化为悬浮培养细胞,命名为MDCK-S细胞,进行18S及物种特异性PCR鉴定.将MDCK-S细胞传代至33代,作为主代细胞库(master cell bank,MCB);传代至38代,作为工作细胞库(working cell bank,WCB).MCB及WCB细胞均进行生物学特征、污染情况、透射电镜、成瘤性和致瘤性、染色体变异性及流感病毒敏感性检测.结果 确认MDCK-S细胞为狗源细胞,且未发现突变、缺失等情况,无其他种属DNA污染.MCB及WCB细胞生长状态良好,生长曲线呈"S"型,倍增时间分别为27.78及27.21h;细菌、真菌及支原体检查均为阴性;细胞形态、结构及细胞膜完整,膜上微绒毛较多,表明细胞状态好,不同细胞代次之间差异较小;具有成瘤性,但不具有致瘤性;染色体2 n=(78±2)条占比为86％～96.19％,P29～P50代细胞染色体数目保持稳定;对流感病毒较敏感.结论 成功将MDCK细胞驯化为悬浮培养,并建立了悬浮细胞系MDCK-S.本研究为细胞基质流感疫苗的研发奠定了基础.

目的 将贴壁培养的Vero细胞驯化成悬浮培养细胞,并对其生物学特性进行研究.方法 采用无血清培养和"摇床适应法"对细胞进行培养优化,对其进行成瘤性、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析、透射电子显微镜形态,以及对流感病毒敏感性检测.结果 成功建立悬浮细胞系Vero-S,Vero-S细胞生长期在 24～72 h,平台期在 108～144 h之间,衰退期在 144 h以后,细胞 PDT为 36 h,细胞密度在14.01～14.88×108 个/L之间,细胞平均圆度在 0.73～0.75 之间,细胞直径在 12.12～14.44 μm之间.Vero-S细胞在裸鼠皮下形成肿瘤,而悬浮培养前的Vero细胞不具有成瘤性;STR显示为猴源细胞系;电镜下细胞结构完整;Vero-S细胞对流感病毒感染不敏感.结论 悬浮细胞系Vero-S细胞的生长经历与贴壁细胞类似的生长期、平台期、衰退期,且细胞大小均一,建立的悬浮培养基能够支持Vero-S细胞高密度生长.STR结果表明悬浮Vero细胞具有完全的遗传稳定性,透射电镜下与贴壁Vero细胞无明显区别.为细胞悬浮驯化培养技术提供参考价值,并可用于细胞致肿瘤的机理研究.

流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段.MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产.随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术.通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性.总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具.同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性.

通过目的基因的随机整合方式, 构建得到的CHO表达细胞系, 常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域, 而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象, 这主要是由于位点效应所导致的.为了解决这个问题, 现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组, 将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上的稳定表达区域, 以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定.利用该技术总共获得了2株外源基因(人白蛋白基因) 定点整合细胞系; Western blot结果显示, 细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性;细胞在贴壁状态下, 两株细胞系在第3、12、23、35、50代, 细胞每日表达的HSA质量接近, 且均维持在0. 5pg cell/d;选取一株表达细胞系, 经悬浮驯化后, 在批次条件培养下, 第1、25、50代的悬浮细胞, 在摇瓶内的表达浓度均稳定在13～14mg/L.显示了将外源基因定点整合于CHO细胞基因组内的可行性;且外源基因整合在稳定表达区域后, 重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性.

传统上从鸡胚中分离病毒用于疫苗的生产常常不能满足需求,研究从体外培养的细胞中分离病毒的途径成为当前疫苗生产领域的迫切需要.本研究利用体细胞诱导重编程技术建立永生化细胞系,为应用于疫苗制备等研究和生产奠定基础.通过慢病毒载体转染转录调控因子(NANOG,LIN28和C-MYC)重编程鸡成纤维细胞,并稳定培养至100代,获得永生化的细胞,而后逐步去除细胞因子、血清等添加物,优化细胞系培养体系,并对细胞驯化实现悬浮生长,以获得单位体积最大密度的细胞.研究结果表明:通过转基因将NANOG,LIN28和C-MYC 3个因子整合入细胞中表达,细胞系对碱性磷酸酶染色呈阳性反应,端粒逆转录酶(cTERT)基因在细胞系中显著上调,并稳定培养至100代,使得这些细胞具有自我更新特性和永生化的潜能.确定了培养基中的血清替代物KSR浓度为20％,并撤除了培养基中bFGF等生长因子,为细胞大规模培养应用提供了可能.永生细胞实现悬浮生长,细胞生长倍增时间为21.71 h,最大密度为1.3×106 cells/mL.因此,我们通过重编程技术建立了一株稳定的永生化细胞系,并且使它能在低浓度KSR中悬浮培养,这为疫苗制备等研究和生产提供科学依据.

目的 建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性.方法 运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定性,在5L生物反应器中扩大培养;接种流感和禽流感病毒,测定不同时间HA效价、CCID50滴度,分析其病毒敏感性.结果 成功将ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞(命名为MDCK-XF02细胞)并冻存;不同接种密度培养MDCK-XF02细胞最大增殖密度均达13.0×106 cells/mL以上,且差异无统计学意义(P＞0.05);连续传代培养过程中细胞形态和生长状况稳定,比生长速率差异无统计学意义(P＞0.05);三个代次的MDCK-XF02细胞以2.0×106 cells/mL接种于5L生物反应器,细胞生长状态良好,倍增时间小于21 h,在批培养中细胞浓度高达(14.57±0.47)×106 cells/mL,比生长速率分别为(0.027±0.012)h-1、(0.028±0.013)h-1、(0.027±0.013)h-1 (p＞0.05);接种甲型流感病毒H1N1和H3N2,HA效价达到(6～7)log2 HA/25μL、CCID50为(4.35～4.68) lgCCID50/mL;接种乙型流感病毒B/P和BX-35增殖效果更好,HA效价达到(9～10)log2 HA/25 μL,CCID50为(6.38～7.31) lgCCID50/mL.接种重组禽流感病毒H5亚型Re-5、Re-6、Re-10均能很好的增殖,HA效价达到(7～9)log2 HA/25μL、CCID50为(6.21～6.96)lgCCID50/mL.结论 本研究获得一株具有自主知识产权的流感/禽流感病毒敏感的无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株,实现了生物反应器高密度放大培养,为我国开展流感疫苗研究和生产提供细胞基质,也为其他动物细胞悬浮驯化提供参考.

通过中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)表达系统制备人血清白蛋白(Human serum albu-min,HSA),为HSA及其融合蛋白质药物的制备及功能研究提供依据.首先构建含有目的基因的重组表达质粒pMH3-HSA,通过有限稀释法和Dot blot检测筛选阳性单克隆,随后扩大培养并悬浮驯化,然后运用5 L一次性生物反应器进行高密度放大培养,以无血清培养基B001和F001分别作为基础和流加培养基,以55 r/min、DO 20％ ～40％、pH 6.8～7.4、Tm 37℃为基础参数进行发酵控制,通过细胞计数、SDS-PAGE、Elisa、Western Blot等实验方法,检测发酵过程中的细胞生长状态以及目标蛋白HSA的表达情况,同时与毕赤酵母表达系统制备的HSA进行比较.结果表明:1)成功构建并筛选出了含外源HSA基因的高表达单克隆CHO细胞株;2)在5 L一次性生物反应器中进行流加培养,HSA的最高产量达180μg/mL;3)CHO表达系统产物几乎无降解.综合表明HSA蛋白更适合在CHO系统中进行表达,其蛋白完整性优势在该系统中表现得尤为明显.

为了提升用MDCK悬浮细胞培养生产流感疫苗的效率,克服目前存在的产能低下问题,以期满足日益增长的流感疫苗市场需求和提升应对大流行爆发的能力.通过病毒驯化、稀释流加条件下的细胞生长和产毒能力分析、Semi-perfusion中的细胞高密度培养可行性分析以及ATF灌注反应器过程验证完成过程开发.驯化的病毒加速了其在细胞内的感染扩增,且在稀释流加培养中获得(3.57±0.17)log10(HAU/100μL)的病毒滴度.Semi-perfusion可实现细胞高密度培养至40×106 cells/mL以上,病毒产量达4 log10(HAU/100μL)以上,同时发现MOI和胰酶浓度对病毒的复制过程存在显著影响.在反应器中的ATF灌注培养过程得到了与Semi-perfusion相近的细胞密度及更高的病毒产量4.37 log10(HAU/100μL),并且通过降温措施维持了高密度下的单细胞病毒产量,克服了"细胞密度效应".建立了基于MDCK悬浮细胞ATF灌注培养的流感病毒生产平台,通过同时提高细胞密度和单细胞病毒产率提升了流感病毒的生产效率,为基于细胞培养的流感疫苗产业化生产提供了新选择.

[目的]将购自ATCC的ST贴壁细胞通过自主驯化,使其能在甘肃健顺生物科技有限公司(简称健顺生物)自产的无血清培养基CD ST 258中悬浮生长且能稳定传代,在反应器中能高密度生长.[方法]采用高血清贴壁培养转无血清悬浮培养;单因素实验优化氨基酸、维生素、无机盐等培养基组分;单因素实验优化生物反应器的pH、溶氧和转速三个参数.[结果]悬浮细胞在无血清培养基中传代,72 h细胞密度高于8.0 ×106 cells/mL;反应器中细胞最高生长密度可达3.0 × 107 cells/mL.[结论]ST贴壁细胞可驯化为悬浮细胞,能在无血清培养基中稳定传代且在一次性反应器中可高密度生长.