目的 通过构建靶蛋白固定化磁珠,从威廉环毛蚓Pheretima guillemi中垂钓出与靶蛋白(纤维蛋白原、纤溶酶原)直接作用的抗血栓活性大分子成分,并经液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定.方法 优化并合成纤维蛋白原、纤溶酶原固定化羧基磁珠,分别通过固定化量、透射电镜、傅里叶红外光谱仪、激光纳米粒度分析仪表征功能化磁珠的靶蛋白固定量、微观形态、官能团及表面带电性;利用功能化磁珠从威廉环毛蚓抗血栓部位DPf3中垂钓与靶蛋白直接作用的抗血栓大分子活性成分,洗脱后经 LC-MS/MS 技术分析,并结合威廉环毛蚓物种蛋白质数据库比对鉴定.结果 靶蛋白固定化磁珠的最佳制备方案为将纤维蛋白原(0.4 mg/mL)或纤溶酶原(1 mg/mL)与磁珠于 4℃混旋孵育 8 h,纤维蛋白原和纤溶酶原的最大偶联量分别为(9.84±2.17)μg/mg和(7.24±0.91)μg/mg;经表征,靶蛋白均已成功固定于磁珠表面.DPf3 经纤维蛋白原、纤溶酶原固定化磁珠垂钓所得洗脱液经扫描比对,分别鉴定到 20 种和 27 种蛋白质,多属于丝氨酸蛋白酶类成分.结论 通过磁珠配体垂钓策略和 LC-MS/MS 技术可从威廉环毛蚓中快速筛选和鉴定目标生物活性大分子,可为动物类中药大分子的分离鉴定提供参考.

目的 评价不同生物活性基团修饰的纳米磁珠核酸提取效能,为临床应用及结果评价提供一些依据.方法 通过不同生物活性基团修饰的纳米磁珠对检测乙型肝炎病毒的标本进行核酸提取,采用微量分光光度计(NanoDrop Onec)检测核酸的浓度及纯度,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测样本的CT值.结果 在几种纳米磁珠提取法中,超顺磁性羧基纳米微粒提取的核酸浓度及纯度最高(浓度平均为953.3 IU/mL),其次是二氧化硅磁性微球与羧基微球混合纳米磁珠及纳米磁性氧化物MnFe2O4提取法.羟基修饰二氧化硅颗粒以及壳聚糖包覆的磁珠提取的核酸浓度较高,但纯度较差(A260/280及A260/230比值均超出标准范围).对于同一样本,超顺磁性羧基纳米微粒提取的核酸扩增CT值为(21.28±0.36),核酸提取效率明显高于离心柱提取法,且具有统计学意义.二氧化硅磁性微球和羧基微球混合纳米磁珠、羟基修饰二氧化硅纳米磁珠及壳聚糖包覆的纳米磁珠核酸提取效率均低于离心柱提取法.此外,超顺磁性羧基纳米微粒的提取时间可缩短至15分钟.结论 超顺磁性羧基纳米微粒核酸提取效率、精密度及核酸产物纯度最高,有较大的临床应用价值.

目的 研究红紫珠Callicarpa rubella枝叶的二萜类化学成分及其体外抗炎活性.方法 采用多种色谱方法对红紫珠化学成分进行系统分离纯化,运用核磁共振谱、质谱及X-单晶衍射实验等技术鉴定化合物结构.以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7为抗炎模型,选择6个结构差异明显的二萜类化合物进行抗炎活性评价.结果 从红紫珠石油醚部位和醋酸乙酯部位共分离得到20个二萜类化合物,分别鉴定为kolavic acid-15-metyl ester(1)、rubellapene A(2)、rubellapene B(3)、rubellapene C(4)、13,14,15,16-四降碳-3-克罗-12,18-二羧酸(5)、对映异海松烷-8(14),15-烯-19-羧酸(6)、dichrocephnoids C(7)、15-去甲基半日-8(20)12E-二烯-14-甲醛-19-羧酸(8)、8S-kolavic acid 15-methyl ester(9)、粘叶莸酸(10)、melanocane B(11)、dodovislactones B(12)、tinotufolin B(13)、amphiacric acid A(14)、patagonic acid(15)、(+)-15-methoxyfloridolideA(16)、去甲基-左旋哈氏豆属酸(17)、15-羟基-16-羰基-15,16H-左旋哈氏豆属酸(18)、(-)-顺式-克罗-3,13-烯-16-羟基-15,18-二羧酸-15,16-内酯(19)、polylauioid J(20).结论 首次得到化合物1的单晶X射线衍射晶体结构数据.化合物5、7～14、16～20为首次从紫珠属植物中分离,其余化合物为首次从红紫珠中分离得到,主要以克罗烷型和半日花烷型二环二萜为主.体外抗炎活性实验表明,6个二萜类化合物均能够抑制LPS刺激的小鼠RAW264.7巨噬细胞中NO的分泌,其中化合物1抑制NO能力最强,推测C-13位双键的存在有利于提高抗炎活性.

[背景]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)作为高致病性传染病,给我国生猪养殖业造成了严重的经济损失,因此建立快捷、灵敏的诊断方法至关重要.[目的]建立一种管式非洲猪瘟病毒pp62 蛋白化学发光抗体检测方法.[方法]以重组pp62 蛋白作为包被抗原,羧基磁珠(carboxylic magnetic beads)作为固相载体,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)标记的兔抗猪IgG作为酶标二抗,通过对反应条件进行优化,采用非洲猪瘟国家参考品作为溯源血清绘制出标准曲线,建立基于ASFV pp62 蛋白的化学发光抗体检测方法.[结果]用建立的化学发光方法检测 277 份临床样品血清,通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析确定阴性、阳性临界值,并确定判定标准:浓度值>140.02 U时为抗体阳性,浓度值<140.02 U时为抗体阴性.此方法对 6 种不同的病原血清抗体进行检测均无交叉反应,且批内和批间变异系数均在 10%以内,与商品化非洲猪瘟抗体检测试剂盒的符合率达 96.7%.[结论]本研究建立的管式非洲猪瘟病毒化学发光抗体检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可为非洲猪瘟早期监测及试剂盒研发提供参考.

目的 观察乳康饮(Ru Kang Yin,RKY)刺激γδT细胞增殖对乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤作用,为中医药治疗乳腺癌提供依据.方法 实验分为以下4组,Ⅰ组:外周血单个核细胞(PBMC)对照组;Ⅱ组:PBMC+植物凝集素(PHA)组;Ⅲ组:PBMC+唑来膦酸(ZOL)组;Ⅳ组:PBMC+RKY组.在各组培养0 d和14 d时,用流式细胞术检测各组γδT细胞占PBMC的百分比.将用免疫磁珠分选的γδT细胞与荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的乳腺癌MDA-MB-231细胞以10:1的比例共培养,测定 γδT细胞对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤力.结果 培养0 d时,Ⅰ组～Ⅳ组 γδT细胞占PBMC百分比分别为(3.81±0.27)％、(4.19±0.41)％、(3.94±0.13)％、(4.16±0.11)％,各组间差异无统计学意义(F=1.462,P=0.296).培养14 d时,Ⅰ组～Ⅳ组γδT细胞占PBMC百分比分别为(4.70±0.29)％、(31.09±1.95)％、(25.91±3.77)％、(28.84±2.54)％,各组间差异有统计学意义(F=71.985,P=0.000).Ⅰ组～Ⅳ组对MDA-MB-231细胞的杀伤率分别为(1.17±0.86)％、(1.56±0.13)％、(1.47±0.09)％、(2.01±0.16)％,各组间差异有统计学意义(F=24.649,P=0.000).结论 RKY可以刺激 γδT细胞增殖,提高对MDA-MB-231细胞的杀伤力,为乳腺癌的中医药治疗提供实验依据.

目的:探讨基于DNA片段选择性磁珠纯化法(片段选择富集法)富集胎儿游离DNA结合高通量测序技术在无创产前筛查中的应用价值.方法:选取2019年8月—2021年8月在南京医科大学第一附属医院行胎儿染色体非整倍体无创产前筛查的孕妇共20868例进行回顾性分析,比较传统DNA提取纯化法(传统纯化法)和片段选择富集法在胎儿游离DNA提取纯化质量、无创产前筛查初次检测失败率及胎儿染色体异常筛查准确性方面的差异.结果:共有5914例孕妇采用传统纯化法结合高通量测序检测,其中33例(0.56%)判定为胎儿游离DNA浓度过低需重新抽血复检;而14954例孕妇采用片段选择富集法结合高通量测序进行检测,2例(0.01%)判定为胎儿游离DNA浓度过低需抽血复检,两组存在显著性差异(0.56%vs.0.01%,P<0.001).与传统纯化法(23/5914,0.39%)相比,片段选择富集法结合高通量测序检出目标染色体异常率(21三体+18三体+13三体)(47/14954,0.31%)无明显差异(P>0.05),其中胎儿21三体(54.55%vs.66.67%)、18三体(83.33%vs.60.00%)和13三体(50.00%vs.25.00%)阳性预测值均无显著性差异(P>0.05).经介入性产前诊断及产后随访复核,传统纯化法组和片段选择富集法组各有1例假阴性,两组间染色体异常漏诊率无显著性差异(0.02%vs.0.01%,P>0.05).结论:基于DNA片段选择性磁珠纯化富集法,可以富集母体外周血浆中胎儿游离DNA的含量,减少因胎儿游离DNA浓度过低所致重复抽血的风险,同时不影响目标染色体疾病的阳性预测值.

目的:探讨力生长因子(MGF)对人外周血CD4+ CD25+ CD127-调节性T细胞(Treg)体外增殖的影响.方法:(1)用免疫磁珠法分选20 mL人外周血CD4+CD25+CD127-Treg,流式细胞仪鉴定细胞纯度,用羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记细胞,以不同浓度MGF(0 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L)干预细胞6d后用流式细胞仪检测Treg细胞增殖情况.(2)分离4 mL外周血单个核细胞(PBMC),以不同浓度MGF(0 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L)干预后用流式细胞仪检测Treg细胞占PBMC的比例.结果:分离纯化的Treg细胞,MGF干预后二代细胞占总细胞比例:0 nmol/L MGF组为(49.66±9.86)％,10 nmol/L MGF组为(58.66±5.95)％,100 nmol/L MGF组为(62.6±4.66)％,100 nmol/L MGF组的增殖效率高于0 nmol/L MGF组(P＜0.05).PBMC中Treg细胞比例:0 nmol/L MGF组为(17.82±1.23)％,10 nmol/L MGF组为(20.73±1.61)％,100 nmol/L MGF组为(20.29±1.46)％,10 nmol/L MGF组和100 nmol/L MGF组比例均明显高于0 nmol/LMGF组(P＜0.05).结论:MGF对CD4+ CD25+ CD127-Treg体外增殖具有促进作用.

目的 研究鼠李科马甲子属植物马甲子Paliurus ramosissimus中三萜类化学成分.方法 通过开放硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱等多种方法进行分离、纯化、制备,并通过化合物的理化性质、红外光谱、质谱、核磁共振波谱等方法对化合物进行结构鉴定和解析.结果 从马甲子地上部分的95％乙醇水提取物的醋酸乙酯萃取部分中分离得到6个三萜类化合物,分别鉴定为22β,24-二羟基-A(1)-去甲-2,20(29)-羽扇豆二烯-27,28-二羧酸(1)、大枣烯酸(2)、3-O-原儿茶酰美洲茶酸(3)、美洲茶三酸(4)、2-O-咖啡酰麦珠子酸(5)、3-O-咖啡酰麦珠子酸(6).结论 化合物l为新化合物,命名为马甲子酸A,化合物2～6为首次从该植物中分离得到,且首次报道化合物3的完整核磁数据.

目的 研究循环肿瘤细胞(CTCs)富集和鉴定方法 .方法分别用羧基磁珠制备EPCAM、CK82种免疫磁珠,分成EPCAM组、CK8组、2种磁珠均等混合检测的EPCAM/CK8组3组,对循环肿瘤细胞进行富集,采用HE染色和免疫细胞化学法鉴定细胞.结果 EPCAM组、CK8组、EPCAM/CK8组检测值分别为12.4±7.3、9.8±4.2、21.6±5.9个肿瘤细胞,检测效率差异有统计学意义(P<0.05).结论 EPCAM与CK8联合检测可有效提高非小细胞肺癌CTCs检出效率.

目的 开发一种自动化、经济、定量、操作简便、样本易获得的人表皮生长因子受体2(HER2)的检测方法.方法 本研究采用体外诊断化学发光免疫分析法定量检测血清中HER2蛋白的含量,将HER2单克隆抗体作为一抗包被于羧基磁珠上,并将另一二抗标记于吖啶酯上,进行双抗体夹心检测.结果 本研究建立的HER2蛋白检测方法的检测范围为0～500ng/ml,精密度为CV<5％,分析灵敏度(LOD)为0.075ng/ml,功能灵敏度(LOQ)为0.093ng/ml,线性范围为2.135～780.427ng/ml,用HAMA阳性血清测试抗干扰实验,显示对本试剂盒无干扰,加速稳定性实验显示试剂可稳定存放1年.结论 与在售化学发光试剂相比,本文建立的HER2蛋白检测方法在各项分析性能表现优异.成功搭建了HER2蛋白检测的原型试剂.