目的:研制新型非天然氨基酸标记的HiD-Hin47融合载体蛋白。方法:选择融合蛋白氨基酸序列中合适位置的20个氨基酸位点，利用非天然氨基酸标记技术将原有氨基酸位置插入一种含叠氮基的非天然氨基酸N6-(2-叠氮乙氧羰基)-L-赖氨酸(NAEK)，对不同位点插入NAEK的融合蛋白进行表达和纯化，纯化后产物经SDS-PAGE分析，观察各位点融合蛋白产量，最终E677位点表达稳定性更高，均能达到野生型的70%，选择E677位点表达的融合蛋白与3型和6B型肺炎球菌多糖发生click反应完成偶联，所得结合物纯化后进行动物实验和免疫学检测，并与CRM197、破伤风类毒素(TT)、HiD以常规结合方式与3型和6B型肺炎球菌多糖结合产物进行对比。结果:以HiD-Hin47为载体蛋白的3型肺炎球菌多糖结合物的免疫原性稍优于与其余3组结合物，但差异无统计学意义；以HiD-Hin47为载体蛋白的6B型肺炎球菌多糖结合物的免疫原性显著优于以TT、HiD为载体的结合物，与以CRM197为载体结合物的免疫原性差异无统计学意义。结论:NAEK标记的HiD-Hin47具有作为肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗载体蛋白的潜力，值得进行进一步研究。

目的 探讨25-OH维生素D(25-OH vitamin D,25-OH-VD)对新生儿感染性肺炎(neonatal infectious pneumonia,NIP)的抗炎作用及其作用机制.方法 选取2022年1月～2023年1月成都市妇女儿童中心医院收治的65例NIP患儿,根据病情严重程度,分为轻症组(n=34)和重症组(n=31),另选取同期60例健康新生儿为对照组.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清25-OH-VD,白细胞介素-2(inteleukin-2,IL-2)、γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-1β水平;蛋白免疫印迹法检测外周血单个核细胞中维生素 D 受体(vitamin D receptor,VDR)、细胞核转化生长因子 β(transforming growth factor β,TGF-β)/Yes相关蛋白(nucleus-Yes-associated protein,n-YAP)和细胞核转录共激活因子 PDZ 结合基序(nucleus-transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,n-TAZ)通路相关蛋白表达.脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激人肺上皮细胞构建NIP体外模型,分为Control组、LPS组和LPS+VD组;CCK-8检测细胞活力;qRT-PCR检测各组细胞中细胞色素P450家族成员28B1(recombinant cytochrome P450 27B1,CYP27B1)和VDR的mRNA表达;免疫细胞化学法检测各组细胞YAP阳性细胞核数;免疫荧光检测各组细胞YAP/TAZ复合物核转位;蛋白免疫印迹法检测各组细胞炎性因子相关蛋白表达.结果 与对照组相比,轻症组和重症组患儿血清中IL-2(1.91±0.18 μg/L,2.63±0.27 μg/Lvs 1.05±0.12 μg/L),IFN-γ(1.73±0.13 μg/L,2.18±0.19 μg/Lvs 1.03±0.07 μg/L),TNF-α(1.79±0.08 μg/L,2.38±0.13 μg/L vs 0.97±0.04μg/L)和 IL-1β(2.18±0.07 μg/L,2.59±0.11 μg/L vs 0.96±0.02 μg/L)含量以及 TGF-β(1.67±0.21,2.43±0.42 vs 1.02±0.04),n-YAP(2.08±0.11,4.23±0.37 vs 0.99±0.02)和 n-TAZ(2.47±0.42,4.21±0.58 vs 1.03±0.05)蛋白表达逐渐升高,25-OH-VD(12.57±2.21 μg/L,7.85±2.03μg/L vs 16.76±1.02 μg/L)含量和 VDR(0.73±0.09,0.51±0.06 vs 1.03±0.08)蛋白表达逐渐降低,差异具有统计学意义(F=18.983～56.782,均P＜0.001).细胞实验结果显示,与 Control 组相比,LPS 组细胞存活率在 12h(76.23％±0.73％vs 116.72％±2.14％),24 h(57.23％±0.94％vs 125.76％±1.67％)和 48 h(41.23％±0.56％vs 138.56％±1.35％)时显著降低(t=10.342,26.562,37.821);YAP 阳性细胞数(47.35±3.47 个 vs 12.46±1.34 个)和 YAP/TAZ 复合物核转位率(2.56％±0.32％vs 1.01％±0.06％)升高(t=46.362,26.921);IL-2(2.03±0.09 vs 1.03±0.08),IFN-γ(2.07±0.21 vs 1.02±0.04),TNF-α(2.18±0.11 vs 0.99±0.02)和 IL-1β(3.17±0.42 vs 1.03±0.05)的蛋白表达水平升高(t=28.341,26.713,31.235,47.823),差异具有统计学意义(均P＜0.001),而两组间CYP27B1和VDRmRNA表达差异无统计学意义(t=0.872,0.786,均P＞0.05).与 LPS 组比较,LPS+VD 组在 12 h(85.23％±0.36％),24 h(79.82％±0.63％),48 h(76.28％±0.72％)的细胞存活率和CYP27B1(4.42±0.14),VDRmRNA(5.13±0.56)表达升高,YAP阳性细胞核数(24.41±3.23个)和 YAP/TAZ 复合物核转位率(1.47％±0.26％)降 低,IL-2(1.21±0.06),IFN-γ(1.13±0.42),TNF-α(1.03±0.37)和 IL-1β(1.61±0.58)蛋白表达降低,差异具有统计学意义(t=7.263,19.892,23.145,27.872,26.982,14.762,13.623,18.273,25.314,27.873,22.134,均 P＜0.01).结论 血清 25-OH-VD 水平与 NIP 严重程度相关,外源性给予VD补充可通过调控TGF-β介导的YAP/TAZ核转位机制发挥抗炎作用,减轻NIP损伤.

目的:基于Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)和核因子E2相关因子2/泛素结合蛋白p62(Nrf2/p62)通路研究三臣散(SCP)对脂多糖(LPS)诱导的幼鼠肺部炎症的抗炎及抗氧化作用机制.方法:将76只雄性Wistar幼鼠随机分为空白组(n=12)和造模组(n=64).造模组幼鼠通过LPS经口气管滴注诱导肺部炎症,将造模后幼鼠随机分为三臣散高剂量组(HSCP组)、三臣散低剂量组(LSCP组)、地塞米松组(DEX组)和模型组(Model组),每组16只.HSCP组大鼠给予0.10 g/mL SCP灌胃,LSCP组给予0.05 g/mL SCP灌胃,DEX组给予0.025 g/mL地塞米松灌胃,Model组和空白组给予1 mL/100g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液灌胃,2次/d.分别于第2、4天末次给药后24 h取材(n=8).取材后先行肺部病理切片检测造模是否成功,各组取12只(第2、4天各6只)造模成功幼鼠进行后续指标检测.观察幼鼠的一般情况、体质量,检测凝血四项、血常规,HE染色观察肺组织病理情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测下丘脑发热中枢介质和支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子的含量,检测肺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,免疫印迹法检测肺组织中TLR4、IKBα、p65和Nrf2、p62蛋白表达水平.结果:与空白组比较,模型组幼鼠肺部在第2天出现大量炎症细胞浸润,肺泡结构破坏,肺泡壁出现透明膜,肺泡壁增厚、融合,支气管有片状渗出物;第4天肺泡壁增厚加重,肺泡数量减少,肺间质纤维化.与模型组比较,HSCP组、LSCP组、DEX组幼鼠肺部整体损伤程度更低,其中HSCP组最低.第2天,模型组幼鼠中性粒细胞数、前列腺素E(PGE)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TLR4表达量、MDA含量均高于空白组(P＜0.05),环磷酸腺苷(cAMP)、转化生长因子-β(TGF-β)均低于空白组(P＜0.05);第4天,模型组幼鼠中性粒细胞数、PGE、IL-6、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、TNF-α、MDA含量均高于空白组(P＜0.05),cAMP、TGF-β、IκBα、SOD水平均低于空白组(P＜0.05).第2天,HSCP组幼鼠cAMP、TGF-β高于模型组、LSCP组和DEX组(P＜0.01或P＜0.05),PGE、IL-6、TNF-α、IL-4、MDA 含量低于模型组、LSCP 组和 DEX 组(P＜0.01 或 P＜0.05);HSCP 组幼鼠 IL-10 高于模型组(P＜0.01),TLR4表达量高于LSCP组、DEX组(P＜0.05);DEX组幼鼠TLR4表达量低于模型组(P＜0.05).第4天,HSCP组、LSCP组和DEX组幼鼠cAMP、IL-10、TGF-β高于模型组(P＜0.05或P＜0.05),中性粒细胞、PGE、IL-6、TNF-α、IL-4、MDA含量低于模型组(P＜0.05或P＜0.01).各组幼鼠第4天TLR4、IκBα蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:SCP可以减轻LPS诱导的幼鼠轻型肺部炎症,其作用机制可能是通过调控TLR4/NF-κB通路下游的炎症因子来抑制炎症反应,以及激活Nrf2/p62通路调控与氧化应激相关的因子来抑制氧化应激反应.

目的 探讨萝卜硫素对脂多糖(LPS)诱导的小鼠肺炎的改善作用及核苷酸结合域样受体蛋白(NLRP)3/白细胞介素(IL)-1β/转化生长因子(TGF)-β1 信号通路的影响.方法 ICR小鼠随机分为对照组、模型组、萝卜硫素组(腹腔注射 20 mg/kg的萝卜硫素)、抑制剂组(腹腔注射50 mg/kg的NLRP3 通路抑制剂)、萝卜硫素+激活剂组(腹腔注射 20 mg/kg萝卜硫素、1.5 mg/kg的NLRP3 通路激活剂),每组10 只,除对照组滴入相同体积的生理盐水,其余各组均滴鼻LPS(2 mg/kg)构建肺炎模型,造模成功后 24 h开始药物干预,对照组、模型组腹腔注射等量生理盐水,每天干预 1 次,连续干预 1 w.血气分析仪测定各组动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)值,酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测血清、肺泡灌洗液中炎症因子水平,计数肺泡灌洗液中炎症细胞数量,计算肺湿/干比,苏木素-伊红(HE)染色检测各组肺组织病理变化,以Western印迹检测肺组织中NLRP3/IL-1β/TGF-β1 通路蛋白的表达.结果 与对照组相比,模型组肺组织受损严重,PaO2 值显著降低,PaCO2、肺湿/干值、血清及肺泡灌洗液中炎症因子水平、炎症细胞数量、肺组织中NLRP3/IL-1β/TGF-β1 通路相关蛋白表达水平显著升高(P＜0.05);与模型组相比,萝卜硫素组、抑制剂组肺组织损伤得到缓解,PaO2 值显著升高,PaCO2、肺湿/干值、血清及肺泡灌洗液中炎症因子水平、炎症细胞数量、肺组织中NLRP3/IL-1β/TGF-β1 通路相关蛋白表达水平显著降低(P＜0.05);与萝卜硫素组相比,萝卜硫素+激活剂组肺组织损伤加重,PaO2 值显著降低,PaCO2、肺湿/干值、血清及肺泡灌洗液中炎症因子水平、炎症细胞数量、肺组织中NLRP3/IL-1β/TGF-β1 通路相关蛋白表达水平显著升高(P＜0.05).结论 萝卜硫素对LPS诱导的小鼠肺炎具有一定的改善作用,可能是通过抑制NLRP3/IL-1β/TGF-β1 信号通路实现的.

目的:建立6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物(PS6 B-TT)中游离多糖的测定方法,并对方法进行验证.方法:采用脱氧胆酸钠-盐酸沉淀法(NaDC/HCl),取不同浓度的载体蛋白破伤风类毒素(TT),加入1％ NaDC溶液混匀,离心后用Lowrry法检测上清中蛋白含量,以确定载体蛋白沉淀范围;用不同离子强度的氯化钠溶液稀释游离多糖对照品与TT的混合物,NaDC沉淀并离心后以蒽酮-硫酸法测定上清中多糖含量、计算回收率,确定游离多糖的最佳分离条件;以NaDC/HCl沉淀6B型多糖测定标准品并绘制标准曲线,与未经NaDC/HCl沉淀的标准品相比较,确定NaDC对蒽酮硫酸法测定结果的影响;由此建立NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法测定6B型结合物中游离多糖含量的方法,并对方法的专属性、准确度及精密度进行验证.结果:此方法沉淀载体蛋白浓度应控制在500μg· mL-以下;选择终浓度0.3 mol·L-1氯化钠溶液作为6B型肺炎球菌结合物中游离多糖测定的稀释液;NaDC/HCl沉淀法对蒽酮硫酸法测定多糖含量基本无影响;游离多糖对照品与载体蛋白TT混合物经建立的NaDC/HCl法沉淀后多糖及蛋白回收率分别为98.25％及0;游离糖添加试验回收率均在90％ ～100％;3批结合物游离糖含量测定值其试验内及试验间CV值均在10％以下.结论:本试验建立的NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法可有效分离6B型游离多糖与多糖蛋白结合物,并能够准确、稳定地测定结合物中的游离多糖含量.

目的 制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性.方法 在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间.通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR)比较验证水解物结构的正确性.以1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(1-Cyano-4-(dimethylamino) pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化水解物的羟基,并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)结合,制备结合物PS6A-TTAH;并检测结合物的理化性质.通过抑制ELISA分析原糖、水解物和结合物的抗原性.将小鼠分为2组(PS6A组和PS6A-TTAH组),分别免疫3剂次,用间接ELISA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性.结果 多糖经0.2 mol/L醋酸60℃水解8h后,其相对分子质量大小(KD)由0.03升高为0.51,重均相对分子质量(Mw)由8.127×105 g/mol降为1.175×105 g/mol.核磁共振结果表明,各特征质子的化学位移相比原糖未发生改变.结合物的游离多糖质量分数为4.55％,游离载体蛋白质质量分数为1.08％.抑制ELISA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合.PS6A-TTAH组有剂次加强效应(P分别为0.001、0.004和0.001),其第1～3针免后IgG抗体水平均高于PS6A组,差异均具有统计学意义(P分别为0.001、0.002和0.001).结论 制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团,以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答.

目的 利用肺炎球菌表面黏附素A(PsaA)为蛋白载体研制b型流感嗜血杆菌(Hib)多糖与蛋白的结合疫苗,并研究其在幼龄大鼠体内的免疫原性以及对肺炎球菌导致的急性中耳炎(AOM)的免疫保护作用.方法 运用酰胺缩合法将PsaA与Hib荚膜多糖偶联结合制备多糖蛋白结合疫苗.选取30只约3周龄无特定病原体(SPF)雌性SD大鼠,体重88 ～ 102 g,随机分成实验组和对照组,每组15只.对幼龄SD大鼠进行疫苗接种,实验组接种Hib-PsaA疫苗,对照组接种磷酸盐缓冲液(PBS).每2周接种1次,3次接种后检测动物血清相关抗体免疫球蛋白G(IgG)水平.然后对实验组及对照组大鼠分别以肺炎球菌经鼓膜穿刺注入中耳以诱发AOM,观察2组大鼠发生AOM的炎症反应情况.结果 运用酰胺缩合法将PsaA与Hib多糖偶联结合,结合物的洗脱峰明显前移,表明细菌多糖与载体蛋白结合成功.接种该结合疫苗的实验组幼龄大鼠产生的抗PsaA抗体IgG的几何平均滴度(GMT)为11 138,抗Hib抗体IgG的GMT为7 017,而对照组抗PsaA抗体IgG的GMT与抗Hib抗体IgG的GMT分别为729和348.实验组2种抗体IgG均明显高于对照组(P＜0.001).肺炎球菌攻击后组织病理学检查发现,实验组大鼠在细菌攻击后第3天和第7天中耳炎症反应明显轻于对照组,显示Hib-PsaA结合疫苗对肺炎球菌诱发的大鼠AOM有免疫保护作用.结论 运用酰胺缩合法可成功将PsaA蛋白与Hib多糖偶联结合,所制备的多糖蛋白结合疫苗在幼龄大鼠体内可诱导分别针对PsaA和Hib多糖的有效免疫应答反应,并且可有效预防肺炎球菌导致的大鼠AOM.

目的:研制5型肺炎链球菌荚膜多糖(PN5PS)与白喉无毒突变体(CRM197)结合疫苗.方法:采用还原胺化法制备结合物,即以肺炎5型多糖的邻位羟基作为活化位点,用高碘酸钠进行氧化,形成的醛基与CRM197蛋白上的氨基生成席夫碱反应,在氰基硼氢化钠的作用下形成共价结合物,并将制备的结合物与两种不同铝佐剂吸附,用间接ELISA法检测大鼠血清中针对肺炎5型多糖的抗体效价,比较结合疫苗与不同佐剂吸附前后的免疫原性.结果:当多糖活化度为7.3时,总糖及蛋白的回收率较高,游离糖含量较低,糖蛋白结合比在1.2～2.7时结合疫苗具有较强的免疫原性,结合比为1.9时结合疫苗的免疫原性最强;结合物吸附磷酸铝佐剂后所产生的抗体水平略高于氢氧化铝.结论:通过还原胺化法制备的PN5PS-CRM197结合疫苗具有较好的免疫原性.

细菌性多糖蛋白结合疫苗是一类重要的、安全有效的预防疫苗.目前该疫苗在控制由流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌等引起的感染性疾病中已取得了巨大的成功,尤其是针对两岁以下的婴幼儿.然而,由于缺乏对其免疫激活机制的了解,多糖蛋白结合疫苗仍存在一些问题,如在高危人群中免疫原性较低.因此,了解细菌性多糖蛋白结合疫苗在机体内的免疫应答机制至关重要,以便设计更为合理的疫苗.传统的免疫机制认为,T淋巴细胞活化是由提呈的多肽诱导,即多糖蛋白结合物中载体蛋白部分的加工产物.近年来,已发现T细胞识别多糖的新机制,显示多糖蛋白结合疫苗的多糖部分积极参与T细胞活化.现就近年来细菌性多糖蛋白结合疫苗免疫应答机制的相关研究作一概述.

接种含有肺炎球菌蛋白抗原诸如肺炎球菌溶血素类毒素( dPly)和组氨酸-三联体蛋白D( PhtD)的配方制剂,可扩大抗肺炎链球菌的肺炎球菌结合疫苗( PCVs)血清型相关的保护作用.在欧洲进行的这项多中心、观察者盲的II期临床试验( NCT01204658) ,评估了两种含10种血清型特异性多糖结合物的观察性疫苗PHiD-CV,其分别含有10μg或30μg的dP ly和P htD. 按1 : 1 : 1 :1随机分组的婴儿在2、3、4和12～15月龄时接受4剂的 PHiD-CV/dPly/PhtD-10, PHiD-CV/dPly/PhtD-30, PHiD-CV 或 13 价 PCV ( PCV13 )并与 DTPa-HBV-IPV/Hib共同施用. 通过比较初次接种PHiD-CV(非劣效性目的)疫苗和PHiD-CV/dPly/PhtD疫苗后出现的发热>40.0 ℃,评价疫苗的剂量优势,安全性和免疫原性.