目的:探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)改善卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)小鼠的卵巢损伤及机制.方法:采用足底注射透明带3多肽(zona pellucida 3 peptide,pZP3)方法构建POI小鼠模型,将小鼠分为对照组、佐剂对照组、pZP3组和hUC-MSCs组,每组10只.以阴道涂片监测动情周期、以酶联免疫吸附测定检测血清卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和雌二醇(estradiol,E2)水平,以HE染色观察卵巢组织学,以蛋白质印迹(Western blotting)检测叉头框转录因子O3a(forkhead box O3a,FOXO3a)、p-FOXO3a、p53、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、Bax表达水平,以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测 POI 的标志物骨形态发生蛋白 15(bone morp hogenetic protein 15,BMP15)、抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、WNT、卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)以及促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-1β的表达水平,以RNA-seq检测生长分化因子-15(growth differentiation factor-15,GDF-15)的表达水平.通过环磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)构建体外模型.结果:①造模6周后,与对照组相比,pZP3组和hUC-MSCs组动情周期出现紊乱,且血清FSH水平升高,血清E2水平降低,表明模型构建成功.②相较于对照组,pZP3组闭锁卵泡增加,原始卵泡数目降低,hUC-MSCs干预后小鼠原始卵泡比例和数目均高于pZP3组(P＜0.05).③与对照组相比,pZP3组卵巢中凋亡蛋白p53、Bax表达水平上调,hUC-MSCs干预后小鼠凋亡蛋白p53、Bax表达较pZP3组下调(均P＜0.05);pZP3组体内Caspase-3变化与对照组差异无统计学意义(P＞0.05).pZP3组炎症因子IL-1β、TNF-α表达上调,hUC-MSCs干预小鼠的IL-1β、TNF-α表达较pZP3组显著下调(均P＜0.05).@pZP3组体内Treg细胞数量降低(P＜0.01),hUC-MSCs干预后小鼠Treg细胞数量较pZP3组升高(P＜0.000 1).pZP3组卵巢组织中BMP15、AMH、WNT以及FSHR的mRNA表达水平较对照组降低,hUC-MSCs干预后小鼠的表达水平较pZP3组升高(均P＜0.05).⑤pZP3组FOXO3a磷酸化水平高于对照组(P＜0.000 1),hUC-MSCs干预后,FOXO3a磷酸化水平较pZP3组下降(P＜0.000 1).测序结果提示,pZP3组GDF-15表达上调,hUC-MSCs组中GDF-15表达较pZP3组下调.结论:POI小鼠体内GDF-15和p-FOXO3a表达上调,hUC-MSCs通过下调GDF-15的表达和降低FOXO3a的磷酸化水平,改善POI小鼠的卵巢组织形态,实现对POI小鼠的治疗作用.

目的:探讨羊膜间充质干细胞(AMSC)移植对创伤性脑损伤(TBI)大鼠炎性小体活性的影响。方法:实验采用SD大鼠，分为4组，TBI模型组、生理盐水组、AMSC移植组、假手术组，通过立体定向的方法，将AMSC移植到TBI大鼠损伤周围区域，移植1周后通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)的方法检测TBI大鼠损伤周围区域炎性小体蛋白复合物组分：NLRP1、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、活性半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶1(Caspase-1)的表达，以及下游促炎因子：白细胞介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达；同时采用免疫组织荧光法检测各组大鼠损伤局部的髓过氧化物酶(MPO)和单核/巨噬细胞抗原1(ED-1)的表达，测定各组损伤局部的炎性反应强度。通过改良的神经功能缺失评分(mNSS)，分析AMSC移植对大鼠TBI的治疗作用。对各组炎性小体组分及促炎因子表达水平的组间比较采用采用单向方差分析，移植术后各组间神经功能评分采取重复测量方差分析，进一步的组间比较采用LSD的方法；NS组与AMSC移植组炎性反应强度比较采用两独立样本 t检验。 结果:与假手术组比较，TBI模型组损伤周围区域NLRP1和NLRP3炎性小体复合物各组分及下游促炎因子表达均明显升高：NLRP1(0.98±0.06比12.50±2.00， F＝53.547， P<0.05)、NLRP3(0.99±0.08比12.56±1.93， F＝61.324， P<0.05)、ASC(1.00±0.07比11.07±1.95， F＝52.320， P<0.05)、Caspase-1(1.01±0.09比11.59±1.89 F＝52.306， P<0.05)、IL-1β(1.00±0.04比6.77±1.28， F＝35.365， P<0.05)、IL-18(0.98±0.06比9.64±1.74， F＝44.510， P<0.05)、TNF-α(0.98±0.06比7.26±1.57， F＝38.755， P<0.05)。而与生理盐水组比较，AMSC移植可降低炎性小体复合物各组分及下游促炎因子表达：NLRP1(12.55±1.80比8.06±1.97， F＝53.547， P<0.05)、NLRP3(12.87±2.18比8.76±1.22， F＝61.324， P<0.05)、ASC(12.22±2.25比5.88±1.15， F＝52.320， P<0.05)、Caspase-1(12.43±2.28比6.73±1.33， F＝52.306， P<0.05)、IL-1β(6.98±1.26比3.87±1.12， F＝35.365， P<0.05)、IL-18(9.25±1.82比4.06±1.26， F＝44.510， P<0.05)、TNF-α(8.35±1.42比4.09±1.12， F＝38.755， P<0.05)。与生理盐水组比较，AMSC组可降低损伤周围区域的炎性反应强度。与生理盐水组比较，AMSC移植可促进TBI大鼠神经功能恢复。 结论:AMSC移植对NLRP1和NLRP3炎性小体的抑制作用是其抗炎作用的机制之一，从而促进TBI大鼠的神经功能恢复。

目的:探索女性肿瘤患者在腹腔镜卵巢皮质切除术中获取未成熟卵体外成熟后（ in vitro maturation，IVM）冷冻卵母细胞保存生育力的可行性及有效性。 方法:回顾分析2015年11月至2022年4月期间于北京大学第三医院妇产科生殖医学中心行腹腔镜下卵巢皮质切除术的22例肿瘤患者的一般资料、手术方法及术后随访资料。研究组纳入腹腔镜术中同时获取未成熟卵IVM的患者（ n=14）；对照组纳入仅行皮质切除的患者（ n=8）。分析两组患者的手术时间、出血量、冻存皮质数量等数据，评估该方法的应用价值及安全性。研究组根据取卵方式不同分为两个亚组，经阴道取卵亚组（ n=10）及经腹腔镜取卵亚组（ n=4），分析两亚组患者的手术时间、获卵数、冻存皮质数量等数据，评估不同获卵方式的效率。全部22例患者术后每年进行随访，询问肿瘤治疗情况、月经情况，条件允许者返院复查盆腔超声、性激素水平测定，记录这些患者肿瘤治疗后的卵巢功能并予以适应证范围内的激素替代治疗（hormone replacement therapy，HRT）。 结果:研究组和对照组患者年龄、患病时间、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）水平、冻存皮质数量之间差异均无统计学意义（均 P>0.05），但研究组的基础窦卵泡数（19.71±6.04）、手术时间［（68.07±17.35）min］、出血量［（9.0（5.0，10.5）mL］高于对照组［9.25±3.15， P<0.001；（44.25±16.97）min， P=0.005；3.5（2.0，5.0）mL， P=0.001］，差异均具有统计学意义。14例取卵患者中，经阴道取卵亚组的获卵数［15.5 （11.0，21.0）个］及年龄［（27.00±2.94）岁］显著高于经腹腔镜取卵亚组［4.0 （0.8，10.3）个， P=0.028；（15.75±2.22）岁， P<0.001］，两亚组间患者窦卵泡数、手术时间、冻存皮质数量差异均无统计学意义（均 P>0.05）。接受造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）的7例患者出仓后均出现闭经，疾病缓解后予以HRT，身体发育及生活质量得以维持及改善。 结论:年轻肿瘤患者在进行卵巢皮质切除术时同时获取未成熟卵IVM后冻存可增加生育力保存的机会；经阴道获取未成熟卵的效率更高；HSCT治疗后闭经率高，HRT可以提高患者生活质量。

目的:建立人真皮成纤维细胞（HDF）高糖老化模型，探讨人蜕膜间充质干细胞（dMSC）来源外泌体对高糖老化HDF增殖、迁移、凋亡的影响及其可能机制。方法:采用实验研究方法。收集2021年1—3月解放军总医院第四医学中心收治的4例男性包茎患者（18~22岁）环切术后废弃包皮组织，分离培养获取原代HDF。取第6代HDF，按照随机数字表法分为低糖组和高糖组，分别采用低糖完全培养基和高糖完全培养基进行每72小时换液、不传代培养，10 d后取细胞，于接种后24 h，采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况；于接种后48 h，采用蛋白质印迹法检测细胞衰老相关蛋白p16、p53表达情况；于接种后24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞增殖情况；于接种后48 h，采用脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色法检测细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况；于接种后24 h，采用Transwell实验测定细胞迁移能力。取人dMSC培养48~72 h，采用差速高速离心法获取其外泌体，采用透射电子显微镜观察dMSC外泌体形态，采用纳米颗粒追踪分析法检测dMSC外泌体的粒径分布，采用蛋白质印迹法检测dMSC外泌体标志蛋白CD9、肿瘤易感基因101（TSG101）的表达。取dMSC外泌体及前述高糖完全培养基诱导老化的HDF共孵育24 h，采用PKH67试剂盒检测细胞摄取外泌体的情况。取前述高糖完全培养基诱导老化的HDF，同前分为单纯高糖组、高糖+低浓度外泌体组、高糖+高浓度外泌体组，分别于高糖完全培养基中加入等体积的磷酸盐缓冲液、终质量浓度为50 μg/mL dMSC外泌体、终质量浓度为100 μg/mL dMSC外泌体进行常规细胞培养。分组后同前于对应时间点采用CCK-8法和EdU染色法、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期和凋亡及细胞迁移情况。根据前述结果，另取经高糖完全培养基诱导老化的HDF，分为单纯高糖组、高糖+高浓度外泌体组并同前处理。分组培养48 h，采用实时荧光定量反转录PCR法检测单纯高糖组和高糖+高浓度外泌体组细胞衰老相关的微小RNA-145-5p（miR-145-5p）、miR-498、miR-503-5p及其靶基因钙/钙调素依赖性蛋白激酶1D（CAMK1D）、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（ PTEN基因）和细胞周期蛋白D1的mRNA表达情况。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验和独立样本 t检验。 结果:接种后24 h，高糖组HDF β-半乳糖苷酶阳性染色率为（38.4±4.2）%，明显高于低糖组的（16.5±2.2）%（ t=4.65， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的衰老相关蛋白p16和p53的表达量均明显高于低糖组（ t值分别为11.85、3.02， P<0.05或 P<0.01）。接种后24、48、72 h，高糖组HDF的增殖活性均明显低于低糖组（ t值分别为4.13、9.90、15.12， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的EdU阳性染色率明显低于低糖组（ t=3.83， P<0.05）。接种后48 h，高糖组HDF周期的G2/M+S亚群在3个亚群（G0/G1、S和G2/M）的占比明显低于低糖组（ t=8.74， P<0.01）。接种后24 h，高糖组HDF穿过Transwell滤膜到达下室的细胞数量为（37±6）个，明显少于低糖组的（74±7）个（ t=8.42， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF凋亡率明显高于低糖组（ t=8.48， P<0.01）。dMSC外泌体为边缘清晰、大小分布均匀的杯状或者圆形囊泡，粒径基本处于80~200 nm。dMSC外泌体标志性蛋白CD9、TSG101表达均呈阳性。共孵育24 h，外泌体被HDF摄入胞内，主要分布于细胞核周围。分组培养24、48、72 h，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于单纯高糖组（ t值分别为6.36、6.10、7.76，8.92、12.17、10.74， P<0.01），高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于高糖+低浓度外泌体组（ t值分别为7.92、4.82、4.72， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率均明显升高（ t值分别为5.32、9.88， P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组比较，高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率显著升高（ t=5.27， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF中的G0/G1期亚群占比均显著降低（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05），G2/M+S亚群占比均明显升高（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05）。分组培养24 h，与单纯高糖组相比，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量均明显增多（ t值分别为10.14、13.39 ，P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量明显增多（ t=6.27 ，P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF凋亡率均明显降低（ t值分别为3.72、5.53， P<0.05或 P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF的miR-145-5p、miR-498 mRNA表达量均明显上升（ t值分别为13.03、8.90， P<0.01），miR-503-5p mRNA表达量明显下降（ t=3.85， P<0.05）；高糖+高浓度外泌体组中HDF的CAMK1D、 PTEN基因mRNA表达量均明显低于单纯高糖组（ t值分别为8.83、5.97， P<0.01），细胞周期蛋白D1 mRNA表达量明显高于单纯高糖组（ t=4.03， P<0.05）。 结论:人dMSC来源外泌体可显著提高高糖老化HDF的增殖和迁移能力，抑制其凋亡。这可能与HDF内miR-145-5p和miR-498表达增高抑制了CAMK1D和 PTEN基因的表达及miR-503-5p表达下降促进了细胞周期蛋白D1的表达有关。

目的:探究骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSC）移植对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢的影响及其作用机制。方法:将7周龄40只清洁级SD雌性大鼠按随机数字表法分为4组：假手术组、模型组、移植组、阳性对照组，除假手术组外其余组均进行双侧卵巢切除术构建骨质疏松大鼠模型。模型构建2个月后，移植组大鼠尾静脉注射80 μl/kg含有BMSC的PBS溶液，假手术组和模型组尾静脉注射等量的PBS溶液，阳性对照组大鼠每天灌胃给与仙灵骨葆0.5 g/100 g。治疗14 d后收集各组大鼠血清和股骨。苏木精-伊红染色（HE）观察股骨组织病理学变化；Micro-CT法测量骨密度（bone mineral density，BMD）与骨参数；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测骨钙素、骨保护素、碱性磷酸酶、胰岛素样生长因子1表达水平；分光光度计法测定血清钙、磷、镁水平；蛋白免疫印迹（Western blot）检测各组大鼠股骨中核因子κ b配体受体激活剂（receptor activator of nuclear factor κb ligand，RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（tumor necrosis factor receptor-associated protein 6，TRAF6）和核因子kappa B亚基1（nuclear factor kappa B subunit 1，NF-kB1）蛋白水平表达。结果:与假手术组比较，模型组大鼠BMD降低（0.28±0.01）g/cm 3，骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）降低（19.73±2.02）%，骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）降低（0.082±0.008）mm，骨小梁数量（trabecular number,Tb.N）降低（1.60±0.17）mm -1，骨小梁分离度（trabecular separation/spacing, Tb.Sp）升高（0.273±0.024）mm，骨保护素降低（489.49±55.29）ng/L，碱性磷酸酶降低（229.13±15.05）U/L，胰岛素样生长因子1降低（236.64±14.32）μg/L，骨钙素升高（1.866±0.109）μg/L，钙水平升高（11.98±1.09）mg/dl，磷水平升高（6.85±0.68）mg/dl，镁水平降低（0.62±0.04）mg/dl，RANKL相对表达水平升高（1.05±0.09），OPG相对表达水平降低（0.58±0.08），RANKL相对表达水平升高（0.74±0.10），NF-kB1相对表达水平升高（1.01±0.11）（ P<0.05）；移植组大鼠BMD降低（0.38±0.04）g/cm 3，BV/TV降低（26.73±2.74）%，Tb.Th降低（0.094±0.006）mm，Tb.N降低（2.67±0.09）mm -1，Tb.Sp升高（0.241±0.026）mm，骨保护素基本不变（720.09±67.41）ng/L，碱性磷酸酶基本不变（269.48±14.15）U/L，胰岛素样生长因子1降低（335.95±24.13）μg/L，骨钙素升高（1.392±0.153）μg/L，钙水平升高（7.12±0.53）mg/dl，磷水平升高（4.54±0.32）mg/dl，镁水平基本不变（0.87±0.08）mg/dl，RANKL相对表达水平升高（0.59±0.05），OPG相对表达水平降低（0.97±0.10），RANKL相对表达水平升高（0.45±0.06），NF-kB1相对表达水平升高（0.72±0.06）（ P<0.05）；阳性对照组大鼠BMD降低（0.36±0.05）g/cm 3，BV/TV基本不变（28.72±3.20）%，Tb.Th基本不变（0.096±0.011）mm，Tb.N基本不变（2.85±0.24）mm -1，Tb.Sp基本不变（0.241±0.027）mm，骨保护素降低（716.78±36.90）ng/L，碱性磷酸酶基本不变（270.65±18.59）U/L，胰岛素样生长因子1降低（336.94±17.50）μg/L，骨钙素升高（1.377±0.101）μg/L，钙水平升高（7.13±0.80）mg/dl，磷水平升高（4.58±0.71）mg/dl，镁水平基本不变（0.89±0.04）mg/dl，RANKL相对表达水平升高（0.55±0.08），OPG相对表达水平降低（0.98±0.13），RANKL相对表达水平基本不变（0.40±0.05），NF-kB1相对表达水平升高（0.65±0.09）（ P<0.05）。 结论:BMSC移植可通过调控骨代谢、血清钙、磷、镁水平改善去卵巢大鼠骨质疏松症，这可能与RANKL/OPG/TRAF6通路有关。

目的:探究甲氨蝶呤载药囊泡对小鼠实验性牙周炎的治疗作用。方法:分离人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）的细胞外囊泡（EVs）。构建甲氨蝶呤（MTX）载药囊泡（MTX-EVs）并通过扫描电镜及动态光散射仪（DLS）对构建的载药囊泡进行形态大小分析，通过蛋白质印迹法对其表面特异性蛋白进行鉴定。选取4~5周C57BL/6J雄性小鼠40只，通过盲抓法随机抽取其中8只不做处理，正常饲养作为对照组（由第四军医大学实验动物中心提供），其余小鼠利用脂多糖（LPS）（2 g/L，5 μl）牙周局部注射诱导小鼠牙周炎模型，间隔1天注射1次，诱导2周。将成功诱导牙周炎模型小鼠通过盲抓法随机分为4组，每组8只。分别为LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组。牙周局部治疗2周后，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测牙龈组织炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的质量浓度。通过显微CT（micro-CT）、HE染色评估对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠的牙槽骨吸收情况。流式细胞仪分析牙龈组织中γ干扰素（IFN-γ）阳性细胞的占比。结果:扫描电镜结果显示EVs和MTX-EVs呈圆形或椭圆形，DLS粒径分析证明EVs粒径在200 nm左右，MTX-EVs粒径在300 nm左右。ELISA结果显示，对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度分别为（28.86±2.76）、（51.50±2.04）、（35.26±2.40）、（45.49±2.04）、（35.77±3.49）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度均显著低于LPS组（均 P<0.05）；LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度显著低于LPS+EVs组（ P<0.05）。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度分别为（125.44±4.12）、（221.64±10.59）、（178.16±16.90）、（181.09±18.22）、（170.15±9.04）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度均显著低于LPS组（均 P<0.05）；LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度显著低于LPS+EVs组和LPS+MTX组（均 P<0.05）。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度分别为（320.27±38.68）、（479.62±40.94）、（342.18±25.89）、（415.88±12.01）、（325.75±30.83）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度均显著低于LPS组（均 P<0.05）；LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度显著低于LPS+EVs组及LPS+MTX组（均 P<0.05）。micro-CT扫描结果显示，对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠右上颌第一磨牙第一牙根处釉质牙骨质界到牙槽嵴顶的距离分别为（0.11±0.03）、（0.28±0.02）、（0.23±0.03）、（0.20±0.04）、（0.18±0.03）mm，与LPS组相比，LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组骨吸收均得到不同程度的抑制，差异均有统计学意义（均 P<0.05），其中LPS+MTX-EVs组与LPS+MTX组及LPS+EVs组相比，骨吸收抑制效果最好，且差异均有统计学意义（均 P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示，LPS组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IFN-γ阳性细胞占比分别为（11.77±1.02）%、（6.87±0.65）%及（4.15±0.92）%，LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比均显著低于LPS组（均 P<0.05），LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比显著低于LPS+EVs组（ P<0.05）。 结论:MTX-EVs可有效改善牙周炎模型小鼠牙周局部炎症环境，减少小鼠牙槽骨骨吸收。

目的:探讨外源性肿瘤坏死因子α(TNF－α)对三维环境下小鼠间充质干细胞向汗腺细胞分化的影响及其分子机制。方法:(1)取5只6～8周龄雌性C57BL/6小鼠，用烫伤仪在每只小鼠背部制成1个1 cm 2深Ⅱ～Ⅲ度烫伤创面。伤后1 d，取创面全层皮肤组织，采用酶联免疫吸附测定法检测组织中TNF－α浓度。(2)将0.9 g明胶和0.3 g海藻酸钠混匀后溶于30 mL磷酸盐缓冲液中制成水凝胶，取10只1 d龄雌雄不明C57BL/6小鼠足底全层皮肤研磨成真皮匀浆，从10只7 d龄雌雄不明C57BL/6小鼠股骨和胫骨中分离培养间充质干细胞。混合8 mL预热水凝胶、1 mL小鼠足部真皮匀浆、1 mL第2或3代终浓度为1.5×10 5个/mL间充质干细胞悬液，利用三维生物打印机在培养皿中打印出纵横交错的圆柱块共12块。打印块用25 g/L氯化钙溶液交联10 min，加入间充质干细胞培养基常规培养12 h后，按随机数字表法分为空白对照组和TNF－α处理组，每组6皿、6块。2组打印块均更换新鲜的汗腺诱导培养基培养，TNF－α处理组培养基中另加入终质量浓度为20 ng/mL的TNF－α。培养6 h，采用实时荧光定量反转录PCR法检测各组2皿打印块中间充质干细胞的多能性标志物Nanog mRNA的表达，采用蛋白质印迹法检测各组1皿打印块中间充质干细胞的Nanog蛋白表达，样本数均为3。培养14 d，采用实时荧光定量反转录PCR法检测各组2皿打印块中间充质干细胞的汗腺细胞标志物细胞角蛋白14(CK14)、CK18、钠钾ATP酶蛋白a1(ATP1a1)和水通道蛋白5(AQP5)mRNA表达，样本数为3；采用免疫荧光染色检测各组1皿打印块中间充质干细胞CK14、CK18、ATP1a1和AQP5蛋白表达分布。对数据行独立样本 t检验。 结果:(1)伤后1 d，小鼠烫伤创面组织中TNF－α质量浓度为(19±3)ng/mL。(2)培养6 h，TNF－α处理组打印块中间充质干细胞Nanog mRNA和蛋白表达量分别为0.39±0.04、0.36±0.03，均明显低于空白对照组的1.00±0.05、1.00±0.07( t＝16.51、14.56， P<0.01)。(3)培养14 d，TNF－α处理组打印块中间充质干细胞CK18、CK14、ATP1a1、AQP5 mRNA表达量分别为0.38±0.03、0.42±0.11、0.23±0.06、0.25±0.03，明显少于空白对照组的1.00±0.03、1.00±0.05、1.00±0.05、1.00±0.07( t＝25.31、8.31、17.07、17.06， P<0.01)。(4)培养14 d，空白对照组打印块中间充质干细胞CK18、CK14、ATP1a1和AQP5蛋白均广泛分布于细胞质，而TNF－α处理组打印块中间充质干细胞CK18、CK14、ATP1a1和AQP5蛋白在细胞质的分布较空白对照组明显减少。 结论:外源性TNF－α抑制三维环境下小鼠间充质干细胞向汗腺细胞定向分化，这可能与TNF－α抑制Nanog mRNA和蛋白水平的表达从而使间充质干细胞多向分化潜能下调有关。

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对SAP患者树突状细胞(DCs)成熟、分化的作用及参与炎症调节的机制。方法:采集郑州大学附属郑州中心医院行剖宫产的足月胎儿脐带4～5 cm，原代分离培养hUC-MSCs，采用流式细胞术进行表型鉴定和成脂、成骨染色。采集5例SAP患者外周血20 ml，采用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4、肿瘤坏死因子(TNF-α)进行诱导培养出DCs，根据培养方式不同分为DCs组、hUC-MSCs+DCs组、hUC-MSCs+DCs+NS398组(NS398为NF-κB下游调控基因COX-2的特异性抑制剂)。应用流式细胞术检测DCs表型，测定细胞培养24 h上清液中的IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6 、IL-10水平。采用蛋白质免疫印迹法检测Toll样受体4(TLR4)、IKKα及NF-κB-p65蛋白表达量。结果:成功培养出hUC-MSCs，其表面标志物CD 90、CD 105、CD 73表达阳性，并可向脂肪细胞、骨细胞分化。随着培养时间延长，DCs由未成熟向成熟分化。与DCs组比较，hUC-MSCs+DCs组的调节性DCs(regDCs)比例增加，其标志物CD 11b显著上调[ (14.26±1.25)%比(4.87±0.58)%]，CD 1a 、CD 11c显著下调[(2.81±0.34)%比(13.62±1.52)%、(3.88±0.5)%比(11.8±1.22)%]，差异均有统计学意义( P值均<0.05)。培养上清液IL-1β、INF-γ、IL-6表达下调，但差异无统计学意义；而促炎因子IL-1α显著降低[(14.91±2.58)ng/L比(30.19±7.75)ng/L]，抑炎因子IL-10显著升高[(17.03±4.69)ng/L比(1.83±0.14)ng/L]。NF-κB-p65、TLR4蛋白表达显著下调(0.74±0.02比0.97±0.01、0.89±0.01比1.72±0.01)，IKKα蛋白表达显著上调(1.12±0.01比0.21±0.01)，差异均有统计学意义( P值均<0.05)。与DCs组及hUC-MSCs+DCs组比较，hUC-MSCs+DCs+NS398组的NF-κB-p65与TLR4表达量显著下调(0.34±0.01比0.97±0.01、0.74±0.02，0.14±0.01比1.72±0.01、0.89±0.01)，而IKKα蛋白表达显著上调(1.68±0.01比0.21±0.01、1.12±0.01)，差异均有统计学意义( P值均<0.05)。 结论:hUC-MSCs能够抑制SAP患者DCs成熟、分化，并诱导出CD 11bhigh CD 1alow CD 11clow的regDCs参与免疫调节，其机制可能通过TLR4/IKKα/NF-κB/COX-2途径抑制炎症级联反应，发挥抗炎作用。

目的:探讨肝细胞生长因子（HGF）修饰人脂肪间充质干细胞（ADSC）对糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制。方法:采用实验研究方法。取2019年12月于空军军医大学第一附属医院整形科行腹部抽脂术的1名35岁健康女性术后弃用腹部脂肪组织，采用胶原酶消化法获取呈长梭形的原代ADSC，其第3代细胞经流式细胞仪鉴定阳性表达ADSC表面标志物CD29、CD90，阴性表达CD34、CD45。取第3代ADSC进行后续实验。采用慢病毒介导的HGF转染ADSC 4 h（获得HGF修饰ADSC）后，常规培养24 h，倒置相差显微镜下观察细胞形态并计算转染率。取81只4周龄雄性SD大鼠，通过高糖高脂饮食联合链脲佐菌素注射诱导为糖尿病大鼠模型后，在每只大鼠背部制作1.5 cm×1.5 cm全层皮肤缺损创面。采用随机数字表法，将致伤大鼠分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯ADSC组、HGF修饰ADSC组，每组27只，均分别于伤后1、3、7 d在创周注射相同体积的相应物质。采用随机数字表法选取各组9只大鼠，于伤后0（即刻）、3、7、10、14 d（注射日注射后）测量创面面积并计算伤后3、7、10、14 d创面愈合率。伤后3、7 d行当日注射后分别处死各组剩余大鼠中的9只，取创周皮肤组织，采用实时荧光定量反转录PCR法检测伤后3 d肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、IL-10及伤后7 d Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA表达，采用酶联免疫吸附测定法检测伤后7 d血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平，采用蛋白质印迹法检测伤后3 d核因子κB-p65蛋白表达、伤后7 d蛋白激酶B（Akt）的磷酸化水平。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验及Bonferroni校正。 结果:培养24 h，转染HGF的ADSC形态良好，与未转染ADSC无差异，转染率达90%。伤后3、7、10、14 d，HGF修饰ADSC组大鼠创面愈合率分别为（31.5±1.0）%、（75.2±2.0）%、（92.2±1.3）%、（99.1±1.8）%，显著高于PBS组的（21.4±1.3）%、（61.4±1.5）%、（80.1±2.1）%、（92.4±1.8）%和单纯ADSC组的（25.1±2.1）%、（67.2±1.3）%、（89.3±1.4）%、（95.1±2.1）%（ t=1.452、0.393、0.436、0.211，4.982、3.011、4.211、7.503， P<0.05或 P<0.01）。伤后3 d，与PBS组和单纯ADSC组比较，HGF修饰ADSC组大鼠创周皮肤组织中TNF-α、IL-1β的mRNA表达及核因子κB-p65的蛋白表达均显著降低（ t=7.281、17.700、9.447，6.231、13.083、7.783， P<0.01），IL-10的mRNA表达显著升高（ t=-6.644、-6.381， P<0.01）。伤后7 d，与PBS组和单纯ADSC组比较，HGF修饰ADSC组大鼠创周皮肤组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA表达及VEGF表达水平、Akt磷酸化水平均明显升高（ t=-5.126、-4.347、-5.058、-3.367，-10.694、-19.876、-4.890、-6.819， P<0.05或 P<0.01）。 结论:HGF修饰的人ADSC可显著促进糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面愈合，其机制可能与抑制TNF-α、IL-1β表达，促进IL-10、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及VEGF的表达相关，且可能与抑制核因子κB信号通路、促进Akt信号通路有关。

目的:探讨小鼠炎症创面组织匀浆体外模拟创面炎症微环境的可行性。方法:(1)取10只8周龄C57BL/6雄性小鼠，在背部中线两侧用打孔器各取直径1.0 cm的圆形全层皮肤组织，制作正常皮肤组织匀浆上清液。形成全层皮肤缺损创面48 h后，取距创缘2 mm内创面组织，制作炎症创面组织匀浆上清液。取2种组织匀浆上清液，调整总蛋白质量浓度为1 mg/mL，酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量，样本数为6。(2)取原代人脐带间充质干细胞(hUCMSC)并培养至第3代，培养48 h后提取正常外泌体。另外取第3代hUCMSC，分别加入总蛋白质量浓度为30、50、100 μg/mL正常皮肤组织匀浆上清液和炎症创面组织匀浆上清液，培养48 h后，提取30、50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体和30、50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体。取正常外泌体、30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体和30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体，透射电子显微镜下观察外泌体形态，纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径，蛋白质印迹法检测CD9和CD63表达。(3)取1 d龄C57BL/6小鼠乳鼠20只，分离培养原代成纤维细胞(Fb)和第3代Fb，倒置相差显微镜下观察细胞形态。取第3代Fb，培养2 h，利用细胞爬片法结合免疫荧光法观察波形蛋白的表达。(4)取第3代Fb，按随机数字表法分为对照组，正常外泌体组，30、50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组及30、50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组，每组4孔。对照组不进行任何处理，其余7组依次加入实验(2)中制备的正常外泌体，30、50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体和30、50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体，并调整外泌体终质量浓度为10 μg/mL。培养48 h，采用细胞计数试剂盒8法检测8组细胞活力。(5)取2个批次第3代Fb，同实验(4)进行分组及处理，每组4孔，并分别调整外泌体终质量浓度为1、10 μg/mL，采用细胞划痕试验检测培养6、12、24 h细胞迁移率。(6)取2个批次第3代Fb，同实验(4)进行分组及处理，但不设置对照组，每组3孔，并调整外泌体终质量浓度为1、10 μg/mL，实时荧光定量反转录PCR法检测培养48 h转化生长因子β 1(TGF-β 1)、TGF-β 3、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Bonferroni法。 结果:(1)伤后48 h，小鼠炎症创面组织匀浆上清液中TNF-α含量为(116±3)pg/mL，显著高于正常皮肤组织匀浆上清液的(97±5)pg/mL， t＝3.306， P<0.05。(2)hUCMSC正常外泌体、30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体、30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体均呈典型茶托样；3种hUCMSC外泌体粒径为30～150 nm，均在外泌体正常粒径范围内；3种hUCMSC外泌体CD9和CD63均呈阳性表达。(3)原代细胞轮廓清晰，呈突起的纺锤形、不规则多角形或细长条状；第3代细胞形态与原代细胞相近。培养2 h，细胞中波形蛋白呈阳性表达，细胞鉴定为Fb。(4)培养48 h，30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞活力为(137.4±2.8)%，明显高于对照组的100%、正常外泌体组的(107.5±2.4)%、30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组的(113.3±3.2)%及50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组的(104.0±2.0)%、(101.9±1.5)%， P<0.01, 30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组细胞活力明显高于对照组、正常外泌体组及50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组[(103.4±2.2)%、(102.5±1.4)%]， P<0.01。(5)外泌体终质量浓度为1 μg/mL时，培养6、12、24 h，30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组、30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组及50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组( P<0.05)；培养12 h，30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组以及50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组( P<0.05)。外泌体终质量浓度10 μg/mL时，培养6 h，30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组( P<0.05)；30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组( P<0.05)。培养12、24 h，30 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组及50、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组( P<0.05)；30 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组细胞迁移率明显高于对照组、正常外泌体组及50、100 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组( P<0.05)。(6)外泌体终质量浓度1 μg/mL时，7组细胞培养48 h TGF-β 1、TGF-β 3、α-SMA mRNA表达量组间总体比较，差异无统计学意义( F＝1.123、1.537、1.653， P>0.05)。外泌体终质量浓度为10 μg/mL时，培养48 h，7组细胞TGF-β 1、α-SMA mRNA表达量组间总体比较，差异无统计学意义( F＝1.487、1.308， P>0.05)。50 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞培养48 h TGF-β 3 mRNA表达量明显高于正常外泌体组、50 μg/mL正常蛋白刺激外泌体组及30、100 μg/mL炎症蛋白刺激外泌体组( P<0.05)。 结论:小鼠炎症创面组织匀浆上清液预处理对hUCMSC外泌体的总蛋白含量无影响，低浓度炎症创面组织匀浆上清液刺激所得的hUCMSC外泌体能够上调Fb的增殖和迁移能力，但炎症创面组织匀浆上清液中的炎症介质含量过低，不足以有效启动间充质干细胞抗炎及组织修复旁分泌效应。