本文阐述了肌少-骨质疏松症所涉及的肌肉和骨骼间的复杂串扰和密切联系及其发病机制,并概括性指出其治疗难点在于需要同时兼顾肌肉和骨骼.还阐述了 Hedgehog通路对于胚胎发育、组织形态建立以及人体组织的再生和修复的关键作用.从肌肉干细胞的增殖和分化、前体细胞和肌纤维生成、抑制炎症和调控免疫3个方面探讨了 Hedgehog通路对骨骼肌的重塑作用;从促进骨形成和抑制骨吸收2个方面阐述了 Hedgehog通路在骨重建中的作用.

目的:研究小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1经成骨诱导后压电型机械敏感离子通道组件1 (PIEZO1)的表达变化及意义。方法:成骨诱导MC3T3-E1细胞后，于第0、14、21天分别进行茜素红染色观察钙结节和细胞形态，利用蛋白质印迹法(Western blot)、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分别检测成骨诱导对各时间点PIEZO1蛋白和PIEZO1 mRNA表达的影响，组间比较采用One-way ANOVA检验。结果:MCET3-E1成骨诱导0 d时基本未见红色钙化结节，细胞呈梭形；诱导14 d时出现钙化结节，细胞呈聚集样和层叠样生长，且随着诱导时间延长钙化结节数量增多，形状逐渐增大，细胞层叠样生长加重；同时MC3T3-E1中PIEZO1蛋白及mRNA的表达量随着成骨诱导时间的延长而逐渐增高(PIEZO1蛋白0 d组0.26±0.04、14 d组0.42±0.16、21 d组0.81±0.04， F＝24.05， P<0.001；PIEZO1 mRNA 0 d组1.00±0.03、14 d组1.45±0.11、21 d组4.51±0.44， F＝161.90， P<0.001)，差异有统计学意义。 结论:成骨分化可促进MC3T3-E1在矿化结节形成期PIEZO1蛋白的表达。

目的:构建双层含骨基质骨器官芯片并用于体外模拟成骨细胞和破骨细胞分化，为抗骨质疏松药物开发提供新平台。方法:使用WorkSoild软件制作双层双通道骨器官芯片设计图，利用光刻技术制备浇注母版。以聚二甲基硅氧烷（PDMS）为原料，通过模具浇注制备芯片主体。以牛皮质骨片为间隔，分隔培养室4个通道进出口采用储液柱封闭。芯片验证实验分为成骨、破骨诱导组和成骨、破骨对照组，成骨、破骨诱导组将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1和小鼠巨噬细胞RAW264.7分别接种于芯片上，成骨诱导14 d，破骨诱导7 d。成骨、破骨对照组为不进行诱导的MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞。观察指标包括：（1）芯片外观及密封性：芯片制备完成后拍照观察外观并通过密封实验观察密封性能。（2）生物相容性：MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞接种于芯片培养3 d及培养1、3、5 d后，分别采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶（AM/PI）染色和细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）实验观察细胞存活情况。（3）成骨分化情况：对成骨诱导组细胞进行碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色观察成骨细胞诱导情况。收集成骨诱导组和成骨对照组细胞RNA，qPCR检测成骨细胞标志基因Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原（COL1A1）表达情况，观察成骨细胞分化程度和成骨能力。（4）破骨分化情况：对破骨诱导组细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞分化情况。提取破骨诱导组和破骨对照组细胞RNA进行破骨分化基因qPCR，检测破骨细胞标志基因TRAP、组织蛋白酶K（CTSK）和树突状细胞特异性跨膜蛋白（DC-STAMP）表达水平。结果:双层含骨基质骨器官芯片大小为3 cm×3 cm，整体透光，芯片系统结构对接紧凑，无渗液。钙黄绿素AM/PI染色结果显示，MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养3 d后，呈红色荧光死细胞极少。CCK-8实验结果显示，MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养5 d内，细胞活力均在90%以上，表明芯片生物相容性好，细胞可以正常存活并增殖。ALP染色和茜素红染色结果显示，成骨诱导14 d，成骨诱导组MC3T3-E1细胞成功分化为成骨细胞并产生钙化结节。qPCR结果显示，成骨诱导组MC3T3-E1细胞的RUNX2相对表达量为4.98±0.74，显著高于对照组的0.99±0.03（ P<0.01）；MC3T3-E1细胞的OCN相对表达量为7.98±0.76，显著高于对照组的1.00±0.06（ P<0.01）；MC3T3-E1细胞的COL1A1相对表达量为7.07±0.56，显著高于对照组的0.97±0.03（ P<0.01）。TRAP染色结果显示，破骨诱导7 d，破骨诱导组RAW264.7细胞形成巨大的多核破骨细胞，破骨细胞表达大量TRAP蛋白。qPCR检测结果显示，破骨诱导组RAW264.7细胞的TRAP相对表达量为3.35±0.37，显著高于对照组的1.01±0.06（ P<0.01）；RAW264.7细胞的CTSK相对表达量为3.46±0.79，显著高于对照组的1.01±0.05（ P<0.01）；RAW264.7细胞的DC-STAMP相对表达量为1.92±0.12，显著高于对照组的0.98±0.08（ P<0.01）。 结论:双层含骨基质骨器官芯片结构紧凑，可长期体外培养，生物相容性好，可进行成骨和破骨细胞分化诱导，有望为骨质疏松机制探究和药物筛选提供新的研究平台。

目的 研究负载槲皮素的明胶三维多孔(G-quercetin)微球作为骨组织材料的可行性.方法 利用乳化法制备负载槲皮素的多孔明胶微球,扫描电镜观察微球形态,通过免疫荧光染色、活死细胞染色和CCK-8、碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红染色检测微球的细胞毒性及其对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)黏附、增殖及分化的影响,RT-PCR检测成骨相关基因Runx-2、ALP、OPN、OCN表达.结果 扫描电镜结果显示制备的载槲皮素明胶三维微孔材料具有多孔结构.细胞黏附检测显示细胞能够在微球表面铺展良好.与对照组相比,活死细胞染色、CCK-8 结果显示该微球无明显细胞毒性(P＞0.05);与G-quercetin微球共培养的MC3T3-E1 ALP表达和体外矿化增加;PCR结果显示 Runx-2、ALP、OCN、OPN表达明显增高(P＜0.05).结论 载槲皮素明胶微球具有良好的生物相容性,能够促进MC3T3-E1 体外成骨分化,有望作为新型骨组织工程生物材料应用于临床.

背景:Atf7ip是否参与成骨分化的调控尚未明确,研究其对成骨分化的影响及具体机制具有重要意义.目的:探讨Atf7ip对骨形态发生蛋白2促小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化的影响.方法:将体外培养的MC3T3-E1细胞分为正常组、干扰组(NC-siRNA组、Atf7ip-siRNA组)、高表达组(CMV-VC组、CMV-Atf7ip组),转染处理24 h,然后使用200 ng/mL骨形态发生蛋白2分别处理0,12,24,48 h,qRT-PCR检测各组细胞中Atf7ip、碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原α1的mRNA表达水平,Western blot检测成骨分化标记分子Sp7、Runx2的蛋白表达以及Atf7ip结合分子SETDB1、组蛋白H3、H3K9me3甲基化的表达,并进行碱性磷酸酶活性分析.结果与结论:①随骨形态发生蛋白2处理时间增加,Atf7ip的蛋白及mRNA表达减少,而Sp7、Runx2的蛋白表达和骨钙素、碱性磷酸酶的mRNA表达显著增加(P<0.05);Atf7ip结合分子SETDB1的蛋白表达并无明显改变;②与NC-siRNA组比较,Atf7ip-siRNA组Sp7、Runx2的蛋白表达和骨钙素、Ⅰ型胶原α1的mRNA表达显著上调(P<0.05),碱性磷酸酶活性明显增强,且H3K9甲基化明显降低(P<0.05);③与CMV-VC组比较,CMV-Atf7ip组Sp7、Runx的蛋白表达和骨钙素、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原α1的mRNA表达显著下调(P<0.05),碱性磷酸酶活性显著减弱,而CMV-Atf7ip组的H3K9甲基化蛋白较对照组明显上调(P<0.05);④结果表明,Atf7ip在骨形态发生蛋白2诱导MC3T3-E1成骨分化过程中表达降低,敲降Atf7ip后成骨分化显著增强,过表达Atf7ip后成骨分化显著减弱,即Atf7ip是骨形态发生蛋白2促MC3T3-E1细胞成骨分化的负调节因子.

目的:明确染料木素(genistein,GEN)对成骨分化的作用并探讨由富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)负载的GEN对肥胖小鼠骨缺损修复过程的影响.方法:体外实验中,采用CCK8测定7天内不同浓度GEN(0、0.1、1、10、50 μmol/L)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1)增殖的影响;利用碱性磷酸酶(ALP)染色及ALP活性定量检测,明确细胞中ALP活性的变化.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印迹法检测成骨分化过程中ALP、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的RNA及蛋白表达水平,用茜素红染色明确GEN对 MC3T3-E1矿化程度的影响.利用扫描电镜观察PRF载药前、后超微结构变化,验证PRF载药的可行性.体内实验中,采用高脂饮食饲喂法建立肥胖C57小鼠模型.制作直径2.8 mm的颅骨缺损模型,将制备好的GEN/PRF复合物置入骨缺损区.利用Micro-CT扫描及H-E染色评估GEN对肥胖小鼠颅骨缺损修复的影响.采用GraphPad Prism 5.0软件包对数据进行统计学分析.结果:CCK8结果显示,7天内,0.1、1 μmol/L GEN促进细胞增殖(P＜0.05);10 μmol/L GEN对细胞增殖过程无明显影响;50 μmol/L GEN从第2天开始,显著抑制细胞生长,具有细胞毒性(P＜0.05).在MC3T3-E1成骨分化过程中,0.1 μmol/L GEN在一定程度上增加ALP、OPN和OCN蛋白表达(P＜0.05).1、10 μmol/L GEN显著增强ALP活性(P＜0.05),上调ALP、OPN和OCN的RNA及蛋白表达水平(P＜0.05),促进MC3T3-E1中钙结节形成(P＜0.05),2个浓度促进细胞成骨分化的效果相似.扫描电镜发现,PRF内部呈现三维网状结构,为加载药物分子进行局部缓释提供了空间.体内实验中,高脂饮食组小鼠体重大于正常饮食组体重的27.7％(P＜0.05),并出现葡萄糖耐量异常(P＜0.05).Micro-CT显示,与正常饮食组相比,肥胖小鼠股骨中骨小梁数目减少(P＜0.05),骨小梁间距增宽(P＜0.05),骨密度降低(P＜0.05).此外,PRF加载的GEN(0.1、1.0 μmol/L)可增加肥胖小鼠颅骨的骨体积分数(P＜0.05).H-E染色结果显示,GEN/PRF复合物可促进骨缺损愈合.结论:GEN显著促进MC3T3-E1成骨分化,加载PRF后可有效加快肥胖小鼠颅骨缺损愈合.

目的:研究Lmo7 基因对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1 cells)增殖、迁移及成骨能力的影响.方法:体外培养MC3T3-E1 细胞并对其进行成骨诱导,在 0、3、7、14 d时收样,通过实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)与蛋白质印迹法(Western blotting)验证Lmo7 的表达变化.利用慢病毒转染pLV-shLmo7 获得稳定干扰Lmo7 表达的细胞株,并通过CCK-8 实验、EdU细胞增殖实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测Lmo7 对细胞增殖、迁移能力的影响.通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色法检测ALP的表达活性,通过RT-qPCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、Osterix、ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达.结果:Lmo7 基因在成骨诱导的过程中表达上调.成功构建了Lmo7 干扰的稳转细胞株,其增殖活性显著提高,而迁移能力受到抑制.对其进行成骨诱导后发现,与对照组相比,Lmo7 干扰稳转株的ALP染色较浅,成骨相关基因Runx2、Osterix、ALP、OCN表达水平明显下调,且差异具有统计学意义(P<0.05).结论:Lmo7 低表达后可促进细胞增殖,抑制细胞迁移,下调Runx2、Osterix、ALP、OCN的表达能够抑制MC3T3-E1细胞体外成骨分化.

转录因子配对相关同源框1(paired related homeobox 1,Prrx1)作为一种间充质细胞的标志物,不仅参与胚胎时期的骨发育过程,亦在机体成年后骨稳态的调节与损伤后的修复过程中发挥作用.Prrx1+细胞是间充质细胞的一种亚群,作为成骨的前体细胞参与骨骼的发育与形成.本文对Prrx1及Prrx1+细胞在骨发育及骨改建中的作用及影响进行综述.

目的:本研究旨在探讨牙发生相关磷蛋白(odontogenesis-associated phosphoprotein,Odaph)对成骨细胞粘附及矿化的影响.方法:实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测小鼠骨组织中 Odaph的表达;Odaph过表达慢病毒感染小鼠胚胎成骨细胞前体细胞 MC3T3-E1,qRT-PCR检测 Odaph 过表达对 MC3T3-E1 的影响;qRT-PCR、Western blot 和免疫细胞化学法分别检测 Odaph 过表达对粘附标志物 Lamininγ2 和Integrinβ6 表达的影响;Odaph和 Lamininγ2 质粒共转染至人胚肾细胞-293T(human embryonic kidney cells-293T,HEK-293T),免疫共沉淀验证两者是否存在相互作用;MC3T3-E1 经诱导矿化后,qRT-PCR 检测矿化相关标志物ALP、OCN和 Runx2 的表达,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察 ALP活性.结果:研究显示 Odaph在小鼠骨组织和 MC3T3-E1 中表达;Odaph过表达促进了 Lamininγ2 和 Integrinβ6 的表达,且 Odaph与 Lamininγ2存在相互作用;矿化诱导后 Odaph过表达促进 ALP、OCN 和 Runx2 的表达,并且增强了 ALP 活性.结论:Odaph具有促进成骨细胞粘附及矿化的作用.

目的 观察六味地黄方对去卵巢(OVX)大鼠氧化应激相关指标、骨转换标志物及股骨叉头框蛋白O1(FOXO1)表达的干预作用,并探讨其能否通过FOXO1来发挥抗氧化作用及其作用机制.方法 (1)动物实验.将雌性Wistar大鼠分为正常组、假手术组、模型组、补佳乐组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组、六味地黄方大剂量及小剂量组,药物干预8周后检测骨髓活性氧(ROS)、血清抗氧化指标[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、还原型谷胱甘肽(GSH)]、骨转换标志物[骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OCN)、血清I型胶原羧基末端肽(CTX-I)]及股骨FOXO1蛋白表达.(2)细胞实验.制备对照组含药血清和低、中、高剂量含药血清.①将胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)分为正常组、模型组、对照含药血清组,以及低、中、高剂量含药血清组和NAC组,检测各组细胞FOXO1蛋白表达.②沉默MC3T3-E1细胞的FOXO1基因表达,以Western blot法验证后,将细胞分为正常组、模型组、NAC组、高剂量含药血清组、siNC组、siFOXO1组、siFOXO1+高剂量含药血清组,检测各组细胞的增殖及ROS水平.③将MC3T3-E1细胞分为正常组、模型组、NAC组、对照含药血清组,以及高剂量含药血清组,检测各组细胞p-FOXO1蛋白表达.结果 (1)动物实验:与假手术组比较,模型组SOD、CAT、GSH-PX、GSH、BALP、OCN水平均明显降低(P<0.05),CTX-I、ROS水平及FOXO1蛋白表达均明显升高(P<0.05);与模型组比较,六味地黄方大剂量组SOD、CAT、GSH-PX、GSH、BALP、OCN水平均明显升高(P<0.05),CTX-I、ROS水平及FOXO1蛋白表达均明显降低(P<0.05).(2)细胞实验:①与正常组比较,经H2O2 处理的MC3T3-E1细胞FOXO1蛋白表达明显增加(P<0.05);含药血清各剂量组FOXO1蛋白表达均低于模型组(P<0.05);②沉默MC3T3-E1细胞FOXO1基因后,siFOXO1组在48 h及72 h细胞增殖均明显低于模型组和siNC组(P<0.05),ROS水平明显高于模型组和siNC组(P<0.05);siFOXO1+高剂量含药血清组在各时间点细胞增殖均明显高于模型组和siFOXO1组(P<0.05),但都明显低于高剂量含药血清组(P<0.05);ROS水平明显低于模型组和siFOXO1组(P<0.05),但明显高于高剂量含药血清组(P<0.05);③通过检测p-FOXO1发现,模型组p-FOXO1/GAPDH明显低于正常组(P<0.05);高剂量含药血清组p-FOXO1/GAPDH明显高于模型组(P<0.05).结论 六味地黄方能抑制OVX大鼠骨髓ROS水平,提高血清抗氧化水平,促进OVX大鼠骨形成,抑制骨吸收,其机制可能部分与促进成骨细胞FOXO1磷酸化有关.