目的 制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus re-ceptor-related immunoglobin domain-containing protein,PVRIG)双特异抗体,探究其体外生物学活性.方法 用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体,将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析;采用流式细胞术(Fluorescence activated cell sor-ting,FACS)检测双特异性抗体的结合活性;采用生物干涉膜技术(Bio-layer interferometry,BLI)检测双特异性抗体亲和力;用 Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG 细胞和 293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用;采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度.结果 SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度＞95％;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95.采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析,其纯度均＞90％.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.168 70 μg/mL 和 0.038 65 μg/mL,与 293T-cyno-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.037 14 μg/mL 和 0.031 98 μg/mL,与 Human PVRIG Protein,His Tag的亲和力为 1.74E-10M 和 1.69E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体和 TIGIT 的人源化抗体 hT1 与 293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.070 27 μg/mL 和 0.031 21 μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line 的 EC50 分别为 0.020 28μg/mL 和 0.028 22 μg/mL;与 Human TIGIT Protein,His Tag 的亲和力为 8.50E-10M 和 8.47E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体具有阻断 PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG 相互作用活性,且 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 的 EC50为 0.007 μg/mL,优于单独人源化抗体 hT1(EC50为 0.013 μg/mL)和 hP1(EC50为 0.048 μg/mL)的作用.在含 pp65 peptide 条件下 KY-TIGIT-h1gG4M-PVRIG-SCFV 抗体分泌 IFN-r 为 349.72 pg/mL,明显高于其他抗体.结论 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物.

目的:探讨肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)和黏附素MrkD优势抗原表位融合蛋白对KP感染小鼠的免疫保护作用。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP ompA和mrkD序列，通过生信分析选取这两个蛋白的优势抗原表位，经融合聚合酶链反应(PCR)扩增表位序列后克隆至pColdI载体，并转入本科室保存的大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，Ni ＋层析凝胶纯化后获得重组蛋白rAD。rAD经皮下免疫22只BALB/c小鼠，同时设置22只佐剂对照组。完成免疫程序后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对小鼠血清中的抗体水平和脾脏体外抗原刺激后细胞因子分泌水平进行测定，并对小鼠鼻腔注射KP，观察免疫后的小鼠存活率和肺脏细菌数量。组间比较采用 t检验。 结果:分别扩增出ompA和mrkD抗原表位序列，并成功融合，融合片段大小为1 056 bp，与预测大小一致，克隆至pColdI载体后测序，测序正确。重组表达菌BL21(DE3)-pColdI-rAD经IPTG诱导后破碎收集上清纯化，获得可溶性rAD，大小为38.4×10 3，与预测大小一致。rAD 3次免疫BALB/c小鼠后，免疫组抗体滴度显著高于对照组(170 667.00±59 121.00比0.00±0.00， t＝5.00， P<0.01)。KP感染小鼠后，免疫组小鼠存活率显著高于对照组[(65.00±5.00)%比(0.00±0.00)%， t＝22.52， P<0.01]，免疫组小鼠肺脏细菌数显著低于对照组[(9 500.00±1 384.00) CFU比(87 833.00±25 365.00) CFU， t＝7.55， P<0.01]。脾细胞分离后经rAD刺激，免疫组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)分泌量均显著高于对照组[(115.70±17.21) pg/ml比(24.00±9.17) pg/ml， t＝8.14， P<0.01；(200.30±8.51) pg/ml比(9.00±3.00) pg/ml， t＝36.75， P<0.01；(92.33±6.11) pg/ml比(9.67±1.53) pg/ml， t＝22.73， P<0.01]。 结论:KP OmpA和MrkD优势抗原表位融合蛋白rAD，免疫BALB/c小鼠有助于对KP感染的抵抗。

目的:初步探讨血清外泌体长链非编码RNA（lncRNA）对卵巢上皮性癌（卵巢癌）的诊断价值。方法:（1）收集2018年8月至2019年12月在广西医科大学附属肿瘤医院住院治疗的卵巢肿瘤患者，包括卵巢癌35例（恶性组）和卵巢良性肿瘤20例（良性组）；收集同期在本院体检的健康妇女15例（正常组）作为对照。抽取3组妇女的外周静脉血，采用商品试剂盒分离、纯化血清外泌体；外泌体的鉴定：透射电子显微镜观察外泌体的形态，NanoSight纳米颗粒分析技术分析外泌体的粒径分布，蛋白印迹（western blot）法检测外泌体的特异性标志蛋白分化群（CD） 63、CD 81、肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）的表达情况。（2）随机抽取恶性组中4例卵巢癌患者（恶性测序组）和正常组中3例健康妇女（正常测序组），采用高通量测序技术分析两组妇女的血清外泌体差异表达的lncRNA，并筛选出差异表达明显的lncRNA；实时荧光定量PCR技术验证筛选出的差异表达lncRNA在恶性测序组和正常测序组妇女血清中的表达，进一步扩大样本量（即恶性组、良性组、正常组共70份血清）验证筛选出的差异表达lncRNA在其中的表达。（3）绘制筛选出的差异表达lncRNA诊断卵巢癌的受试者工作特征（ROC）曲线，评价其敏感度和特异度等诊断效能；构建多因子联合诊断模型，通过logistic回归模型结合ROC曲线，评价其对卵巢癌发生的诊断效能。 结果:（1）透射电子显微镜观察，血清外泌体为脂质双层膜结构，一侧呈凹陷的半球形或杯托样；NanoSight纳米颗粒分析技术分析显示，外泌体颗粒的直径峰值为127.6 nm，直径30~150 nm的外泌体颗粒占58.9%；western blot法检测显示，与卵巢癌细胞系SKOV3细胞相比，血清外泌体的特异性标志蛋白CD 63、CD 81、TSG101蛋白的表达强度明显增强。（2）高通量测序技术分析显示，相对于正常测序组妇女，恶性测序组患者血清外泌体中筛选出差异表达lncRNA 425个（其中上调23个、下调402个）；挑选上调、下调表达异常明显的lncRNA 6个，即FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811、CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428，采用实时荧光定量PCR技术对恶性测序组和正常测序组妇女血清进行验证，其表达情况与测序结果一致。随后对这6个lncRNA进一步扩大样本量验证，恶性组患者血清外泌体中FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811的表达水平分别升高至良性组、正常组妇女的1.66、1.84倍，2.05、2.46倍，2.94、2.35倍，CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428的表达水平分别下降至良性组、正常组妇女的29%、34%，40%、46%，42%、42%，同一lncRNA的表达水平在恶性组与良性组、恶性组与正常组中分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.05），而良性组与正常组分别比较，差异均无统计学意义（ P均>0.05）。（3）6个差异表达lncRNA单独诊断卵巢癌的ROC曲线下面积（AUC）为0.722~0.805，具有中等诊断价值。联合因子预测模型1（包括FER1L6-AS2和LINC01811）、联合因子预测模型2（包括CXXC4-AS1、LINC02343和LINC02428）、联合因子预测模型3（包括FER1L6-AS2、CXXC4-AS1、LINC02343和LINC02428）的AUC分别为0.865、0.934和0.962，各联合因子预测模型的诊断效能均显著高于单一lncRNA的诊断效能（ P均<0.05）。 结论:经实时荧光定量PCR技术验证，高通量测序技术是筛选血清外泌体差异表达lncRNA的有效方法；血清外泌体多个lncRNA联合检测对卵巢癌患者的诊断效能显著高于单一lncRNA检测。检测血清外泌体lncRNA可为卵巢癌的诊断提供新的思路。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。

目的:分析CD100对非小细胞肺癌(NSCLC)患者单核细胞杀伤功能的影响。方法:入组2018年3—9月份在郑州中心医院就诊的35例NSCLC患者(NSCLC组)和13例健康对照者(对照组)。分离肺癌组外周血单个核细胞(PBMC)和肿瘤部位、非肿瘤部位的支气管肺泡灌洗液(BALF)及对照组PBMC，纯化PBMC和BALF中的单核细胞，流式细胞术检测单核细胞中膜结合型CD100(mCD100)和CD72表达。使用重组人CD100、抗CD72、重组人基质金属蛋白酶14 (MMP14)或抗CD100抗体刺激NSCLC组肿瘤部位纯化的单核细胞，与NCI-H1882细胞共培养后检测靶细胞死亡比例，培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、颗粒酶A、颗粒酶B表达，单核细胞中CD16表达。组间比较采用 t检验或配对 t检验。 结果:外周血CD14 +mCD100 +细胞比例、CD14 +CD72 +细胞比例、CD100平均荧光强度(MFI)、CD72 MFI在NSCLC组和对照组之间的差异无统计学意义( P>0.05)，NSCLC组肿瘤部位CD14 +mCD100 +细胞比例、CD14 +CD72 +细胞比例、CD100 MFI、CD72 MFI均显著高于非肿瘤部位( P<0.05)。NSCLC组和对照组外周血纯化的单核细胞诱导NCI-H1882细胞死亡比例的差异无统计学意义[(13.95±3.16)%比(13.22±2.40)%， P＝0.451]，但肿瘤部位纯化的单核细胞诱导NCI-H1882细胞死亡比例低于非肿瘤部位的单核细胞[(11.61±2.81)%比(14.19±3.57)%， P＝0.008 7]，肿瘤部位单核细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、颗粒酶A、颗粒酶B水平均低于非肿瘤部位单核细胞( P<0.05)，单核细胞中CD16水平在两组间的差异无统计学意义( P＝0.666)。重组人CD100刺激肿瘤部位纯化的单核细胞后，其诱导NCI-H1882细胞死亡的比例高于无刺激细胞( P<0.000 1)，TNF-α、IL-1β、颗粒酶A、颗粒酶B水平亦高于无刺激细胞( P<0.05)，而抗CD72预处理的单核细胞再使用重组人CD100刺激，其诱导NCI-H1882细胞死亡比例和TNF-α、IL-1β、颗粒酶A、颗粒酶B水平均低于重组人CD100刺激的单核细胞( P<0.05)。重组人MMP14刺激肿瘤部位纯化的单核细胞后，CD14 +mCD100 +比例降低，可溶型CD100(sCD100)水平升高，其诱导NCI-H1882细胞死亡的比例和TNF-α、IL-1β、颗粒酶A、颗粒酶B水平高于无刺激单核细胞( P<0.05)。加入抗CD100后，sCD100水平低于MMP14刺激的单核细胞，其诱导NCI-H1882细胞死亡的比例和TNF-α、IL-1β、颗粒酶A、颗粒酶B水平低于MMP14刺激的单核细胞( P<0.05)。 结论:NSCLC患者肿瘤部位浸润单核细胞CD100脱落不全，导致单核细胞杀伤功能下降，MMP14可能通过促进mCD100脱落和sCD100生成提高肿瘤部位浸润单核细胞的杀伤功能。

目的:初步研究幽门螺杆菌( Helicobacter pylori ，HP)鞭毛蛋白FliD的部分免疫学特征。 方法:原核表达重组FliD蛋白；制备rFliD兔多克隆抗体，同时酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测rFliD特异性免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)与免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)水平；酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)检测rFliD刺激Hp患者外周血单核细胞(peripheral blood monocytes, PBMC)后的γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)及白细胞介素4(interleukin4, IL-4)表达水平；流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测rFliD蛋白刺激胃粘膜上皮细胞(Gastric epithelial cells, GES-1)细胞后的凋亡比例。结果:rFliD原核表达纯化成功；成功制备高效价rFliD兔多克隆抗体，并发现rFliD可诱导家兔产生高水平IgG与IgM，与免疫前血清比差异具有统计学意义( t值分别为5.42、8.18， P值均<0.05))，效价可达1：102 400；与健康对照组(healthy control, HC)相比，HP组rFliD特异性IFN-γ与IL-4均显著增高( t值分别为21.91, 13.57， P值均<0.05)，但产生IFN-γ的水平显著高于IL-4( t＝7.55， P< 0.05)；与磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)对照组相比，rFliD刺激GES-1细胞后24或72 h均可发生显著性凋亡且差异具有统计学意义( t值分别为10.12、10.90， P值均<0.05)。 结论:幽门螺杆菌鞭毛FliD蛋白具有强免疫原性，可诱导产生较强的体液及细胞免疫应答，且细胞免疫应答以IFN-γ高表达的Th2型为主；同时发现其对GES-1细胞存在一定程度的凋亡效应。

目的:探讨肿瘤细胞来源的外泌体对神经母细胞瘤细胞增殖和转移的影响。方法:使用外泌体提取纯化试剂盒对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞培养上清液中的外泌体进行提取和纯化，通过透射电子显微镜、蛋白免疫印记法对外泌体的形态、大小和标志蛋白进行鉴定。根据细胞培养基中是否加入外泌体，分为外泌体组和对照组，利用CCK-8法和Transwell实验检测外泌体对SH-SY5Y增殖活力和转移能力的影响。结果:在透射电子显微镜下可见外泌体为茶托样形状，并被一层磷脂膜所包被，直径在30～150 nm之间；蛋白免疫印记法显示，位于外泌体内、外的标志蛋白TSG101和CD63均有富集。细胞增殖实验结果表明在共培养48 h后外泌体组的细胞存活率为(0.95±0.02)与对照组(0.88±0.05)比较，差异无统计学意义( t＝2.317， P＝0.081 4)；但是在共培养72 h后外泌体组的细胞存活率为(1.09±0.09)较对照组(0.92±0.03)明显提高，且组间差异有统计学意义( t＝3.027， P＝0.038 9)。细胞转移实验结果显示，外泌体组SH-SY5Y细胞的迁移数量为(28.8±5.02)个较对照组(14.8±4.76)个明显增加，且组间差异有统计学意义( t＝4.523， P＝0.001 9)。 结论:神经母细胞瘤细胞来源的外泌体能促进肿瘤细胞的增殖和转移，表明肿瘤来源的外泌体能成为交叉信号传递的平台，在促进肿瘤细胞生长方面发挥自分泌的作用。

目的:探讨脂肪干细胞-细胞外囊泡(ASC-EVs)对肌成纤维细胞转分化过程中转化生长因子β(TGF-β)-Smad信号通路的调控作用。方法:脂肪干细胞来源于南昌大学第二附属医院整形美容科行吸脂术患者的抽吸脂肪。真皮成纤维细胞来源于同一科室包皮环切术患者自愿捐赠的皮肤组织。将脂肪抽吸物离心纯化后经酶消化提取脂肪来源于细胞(ASCs)，扩增后行流式细胞术检测表面蛋白标记物。收集第3～5代ASCs上清液提取胞外囊泡(EVs)，透射电镜观察微观形态，纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight检测粒径分布，流式细胞术检测其膜表面标志性蛋白CD63、Alix和TSG101。用PKH67荧光标记的ASC-EVs与真皮成纤维细胞共培养后，共聚焦显微镜观察细胞对EVs的摄取情况。通过TGF-β1持续诱导真皮成纤维细胞5 d，并添加50、100 μg/ml浓度的ASC-EVs，通过免疫荧光染色，RT-PCR和蛋白质印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及Smad-2/3/4的表达。结果:流式细胞术结果提示，第3代ASCs表面标记物CD73、CD49d、CD90、CD105为阳性，CD34、CD45为阴性。透射电镜下ASC-EVs为圆形膜性囊泡，边缘清晰，由双层磷脂膜包裹。95%以上的ASC-EVs粒径为(30.0～261.0)nm，平均(166.0±86.1)nm。EVs高表达标志蛋白CD63、Alix和TSG101。共聚焦显微镜下可见携带绿色荧光的ASC-EVs被真皮成纤维细胞摄取并分布在胞浆内，部分ASC-EVs在细胞核周围分布。α-SMA免疫荧光染色后，经连续5 d的TGF-β1诱导，共聚焦显微镜下见真皮成纤维细胞中α-SMA绿色荧光的表达显著提高，而采用50 μg/ml和100 μg/ml ASC-EVs作用的真皮成纤维细胞中，α-SMA的表达较未经ASC-EVs作用的真皮成纤维细胞显著降低，但不呈现浓度依赖；细胞α-SMA和Smad-2/3/4的mRNA转录水平较未经ASC-EVs作用的真皮成纤维细胞显著下降，α-SMA和Smad-2/3/4的蛋白表达也显著降低。此外，ASC-EVs可显著降低细胞分泌至上清液中的Ⅰ型胶原的含量，但对Ⅲ型胶原的分泌量无明显干预作用。结论:ASC-EVs抑制瘢痕增生的作用机制可能与抑制真皮成纤维细胞中TGF-β-Smad信号通路，干扰肌成纤维细胞转分化，减少Ⅰ型胶原分泌密切相关。

目的:构建和筛选鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpW的B细胞和T细胞表位。方法:运用生物信息学软件预测OmpW的小鼠B细胞及T细胞表位并合成相应肽段；构建重组质粒pET28a-ompW并原核表达、纯化获得OmpW蛋白；以OmpW蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，2周免疫1次，共3次。第3次免疫后1周，收集小鼠血清、分离小鼠脾细胞培养。分别用OmpW蛋白及不同的T细胞表位肽刺激脾细胞，72 h后收集脾细胞上清。间接ELISA法检测小鼠血清中的特异性IgG抗体水平，双抗夹心ELISA法检测脾细胞上清液中IFN-γ浓度。结果:筛选并构建了5个B细胞表位及4个T细胞表位，B细胞表位分别是OmpW B1、OmpW B2、OmpW B3、OmpW B4、OmpW B5，T细胞表位分别是OmpW T1、OmpW T2、OmpW T3、OmpW T4；间接ELISA法检测结果显示，OmpW B1和OmpW B5能够与OmpW全长蛋白质免疫小鼠的血清发生抗原抗体反应，其 A450值与对照组相比显著升高( P<0.001)；双抗夹心ELISA法结果显示OmpW T4表位刺激的脾细胞上清中的IFN-γ浓度最高，与对照组相比差异有统计学意义( P<0.001)。 结论:成功构建并筛选出OmpW蛋白的两个B细胞表位OmpW B1及OmpW B5和一个T细胞表位OmpW T4。

目的:探索人肝癌细胞HepG2感染寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)后的外泌体miRNA的表达差异，对其靶基因进行预测、分析。方法:以感染复数0.5的ZIKV(ZJ03株)感染HepG2，以超速离心法提取、纯化感染2 d与未感染细胞的外泌体(Exo-ZIKV与Exo-NC)。以透射电镜观察外泌体形态，纳米粒径分析检测外泌体粒径分布，Western blot检测外泌体标志蛋白质等方法鉴定。提取纯化外泌体小RNA，进行miRNA测序与分析，对部分差异表达miRNA采用实时定量PCR验证。生物信息方法分析差异miRNA靶基因。结果:在透射电镜下呈杯托状双层膜小囊泡结构；粒径大小分布几乎一致但Exo-ZIKV浓度(5.24×10 8颗粒/ml )较Exo-NC(3.06×10 8 paritcle/ml)增多。Western blot检测出Hsp70、CD63和CD9蛋白表达，测序分析显示共20个差异表达miRNA，其中12个miRNA表达上调8个miRNA表达下调，上调miRNA多与抗病毒通路相关，差异表达miRNA对应的靶基因主要富集在嘧啶与嘌呤代谢等途径中。 结论:ZIKV感染能刺激HepG2细胞外泌体分泌增加，且引起外泌体miRNA表达变化，这为深入了解ZIKV感染导致肝细胞损伤机制提供新基础，为ZIKV治疗提供新的思路。