探究良方温经汤调控卷曲螺旋卷曲螺旋结构域4(CHCHD4)表达干预寒凝血瘀型子宫内膜异位症(EMs)乏氧环境的机制.冰水浴法制备大鼠寒凝血瘀证模型,在此基础上采用自体移植法建立EMs模型,随机分为模型组,良方温经汤低、中、高(4.7、9.4、18.8 g·kg-1)剂量组及少腹逐瘀汤组,另设假手术组,每组10只,灌胃给药4周.造模期间进行大鼠一般情况观察及阴道涂片,并通过激光散斑衬比成像(LSCI)检测耳部及子宫血流,以判断寒凝血瘀证候情况;给药结束后观察大鼠一般情况;卡尺测量异位病灶面积;免疫组织化学法检测CHCHD4、乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)的定位与表达;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及蛋白免疫印迹检测CHCHD4、HIF-1α mRNA和蛋白的表达.进行EMs患者异位子宫内膜间质细胞(ESCs)原代培养,构建CHCHD4过表达质粒,转染建立CHCHD4过表达ESCs模型.将细胞分为空白对照组、CHCHD4过表达组、CHCHD4过表达+空白血清组、CHCHD4过表达+良方温经汤血清组,蛋白免疫印迹检测CHCHD4、HIF-1α蛋白的表达;并检测葡萄糖消耗量及乳酸水平;MTT法检测细胞增殖情况.结果显示,与正常大鼠相比,造模大鼠出现精神萎靡、饮食饮水减少、动情周期紊乱,耳部及子宫微血管血液循环受阻等寒凝血瘀证候表征.与假手术组相比,模型组大鼠异位病灶隆起,CHCHD4、HIF-1α mRNA及蛋白表达显著升高(P＜0.05);与模型组相比,各给药组大鼠寒凝血瘀表征均有改善,异位病灶面积显著缩小(P＜0.05或P＜0.01),CHCHD4、HIF-1α mRNA与蛋白表达显著降低(P＜0.05或P＜0.01).在细胞模型中,与空白对照组相比,CHCHD4过表达组CHCHD4、HIF-1α蛋白表达、葡萄糖消耗量、乳酸水平、细胞增殖活力均显著升高(P＜0.01);与CHCHD4过表达组相比,空白血清组各指标均无明显变化,良方温经汤血清组CHCHD4、HIF-1α蛋白表达显著下降(P＜0.05或P＜0.01),葡萄糖消耗量、乳酸水平显著降低(P＜0.01),细胞增殖活力显著下降(P＜0.01).由上可知,良方温经汤对寒凝血瘀型EMs的治疗作用与降低CHCHD4表达,进而改善异位病灶及异位ESCs乏氧有关.

针对经典名方温经汤进行处方考证及临床应用研究总结,为该方的物质基准制定及复方制剂开发提供参考依据;通过系统整理相关医书古籍及现代文献报道,结合经典名方复方制剂开发的有关政策要求,对目前存在的疑义问题进行阐述并提出建议.宋·陈自明《妇人大全良方》所载温经汤由9味药组成,其组方药材基原及药用部位选用与2020年版《中国药典》收载品种基本保持一致,其中芍药选用白芍(芍药Paeonia lactiflora的干燥根),桂心选用肉桂Cinnamomum cassia的干燥树皮,莪术选用蓬莪术Curcuma phaeocaulis的干燥根茎;饮片建议选用生品,并参照2020年版《中国药典》收载方法炮制;剂量按照1两=40 g折算,当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术用量各20 g,人参、甘草、牛膝各40 g,处方总量为240 g;所有处方药味分别粉碎成粒度＜6 mm后混合,每服剂量20 g,加水525 mL,煎至280 mL,滤后温服,每日1服.古籍记载温经汤功效为活血调经、温经散寒,现代临床主要用于治疗痛经、月经不调等疾病,其对子宫内膜异位症、盆腔炎以及痤疮、湿疹等皮肤病也有一定的疗效.通过研究明确了温经汤出处历史沿革、处方药味基原、炮制方法、剂量折算、制法及用法、临床应用等内容,可为该经典名方的后期开发与应用提供参考依据.

《古代经典名方目录(第一批)》中的"温经汤",既往认定的方源不正确.经查考,其方源应为宋代王贶所著之《全生指迷方》.《全生指迷方》所记载的"温经汤",已知惟南宋郭坦《十便良方》最早引录,其文字与宋代陈自明《妇人大全良方》相比较略有出入,煎用水量及煎取液量不同."温经汤"煎用水量及煎取液量的折算涉及宋代"盏"容积的确定,而对于宋代"盏"容积的折算,要以当时人的认识为准,北宋朱肱《活人书》对此即有明确的阐释.经分析,"温经汤"煎用水所用盏暨宋时煎药用水所用盏,其容积应是1大盏或1大白盏当今200mL,1盏或1中盏当今100mL,1小盏当今60mL.

目的:采用转换波长高效液相色谱(HPLC)法建立同时测定温经汤颗粒中多种成分含量的方法.方法:Kromasil C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),流动相乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)梯度洗脱,转换波长法检测8种成分含量(0～25 min测定芍药内酯苷、芍药苷、β-蜕皮甾酮、甘草苷、阿魏酸的含量,波长为240 nm;25～65 min测定甘草素、肉桂酸、甘草酸铵的含量,波长为280 nm),柱温30℃.结果:8种成分在各自范围内具有良好线性关系(r≥0.9995),精密度、重复性相对标准偏差(RSD)＜2％,在24 h内稳定性较好(RSD＜2.5％),平均回收率均在98.53％～100.10％,RSD均在0.98％～2.16％.结论:转换波长HPLC法能够较准确地同时测定温经汤颗粒中8种成分的含量.

温经汤首载于《金匮要略》,《妇人大全良方》之温经汤(名同方异)亦由此发展而来.后世医家多将《金匮要略》之温经汤归为妇人调经之暖剂,临证凡证属虚寒者,滥而用之,亦有取效一二者,然则实难体悟仲景纵横交错、经纬并用制方义理之所在.《妇人大全良方》之温经汤主治寒实血瘀之证,以血寒积结胞门为甚,直中方名之意,温经散寒而活血消积,功专于破;而《金匮要略》之温经汤集温、养、化、和于一体,寓祛瘀于生新之中,温经于养化之中,更注重妇人久病之体,制方遣药不偏不倚,更具生化之力.

探讨寒凝血瘀证与糖酵解的关系,观察良方温经汤干预对寒凝血瘀证大鼠子宫及卵巢组织糖酵解关键酶表达的影响.采用冰水浴法制备大鼠寒凝血瘀证候模型,于造模结束后进行证候量化评分,并依据评分结果随机分为模型组,良方温经汤低、中、高剂量组(4.7、9.4、18.8 g·kg-1·d-1),每组 10 只,另设空白组 10 只.连续灌胃给药 4 周后,再次进行证候量化评分;采用激光散斑血流成像技术检测各组大鼠耳廓及子宫微循环变化;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察各组大鼠子宫及卵巢组织病理形态;采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)及蛋白质印迹法(Western blot)检测各组大鼠子宫及卵巢组织丙酮酸脱氢酶激酶 1(pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1)、己糖激酶 2(hexokinase 2,HK2)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)mRNA与蛋白表达情况.模型组大鼠出现蜷缩少动、舌下脉络增粗、耳廓及子宫微循环血流灌注量降低等寒凝血瘀证候表现,HE染色观察到大鼠子宫内膜变薄,上皮细胞排列混乱,卵巢中卵泡数量减少;与模型组相比,治疗组大鼠寒凝血瘀证候明显缓解,表现为舌质变红、爪甲肿胀减少、尾端未见瘀血,耳部及子宫微循环血流灌注量显著增加(P＜0.05 或P＜0.01),尤以良方温经汤中、高剂量组大鼠改善寒凝血瘀证候最为明显,子宫可见排列整齐的柱状上皮细胞,卵巢中较模型组卵泡数量增多,多见成熟卵泡.与空白组相比,模型组大鼠卵巢及子宫组织中PDK1、HK2、LDHA mRNA与蛋白表达水平显著升高(P＜0.05 或P＜0.01).与模型组相比,良方温经汤中、高剂量组大鼠卵巢及子宫组织中PDK1、HK2、LDHA mRNA与蛋白表达水平显著降低(P＜0.05 或P＜0.01);良方温经汤低剂量组大鼠子宫及卵巢组织中PDK1、HK2、LDHA mRNA的表达,子宫组织中HK2、LDHA蛋白的表达以及卵巢组织中HK2、PDK1 蛋白的表达均显著降低(P＜0.05 或P＜0.01).综上,良方温经汤对寒凝血瘀证的治疗机制与下调糖酵解关键酶PDK1、HK2、LDHA的表达,抑制子宫及卵巢糖酵解活动有关.