艰难拟梭菌是一种普遍存在于人体肠道中的条件致病菌。当机体在各种诱因下出现菌群失调时，艰难拟梭菌可通过释放其特有的毒素而诱发肠道炎症反应，使患者出现从单纯的腹泻到致命的感染性休克等多种轻重不等的临床症状。近几年，我国多地陆续从患者的粪便样本中检测到BI/NAP1/027型艰难拟梭菌。该型菌株能产生更高水平的毒素和更难杀灭的芽孢，一旦暴发传播，将给全球公共卫生安全带来巨大的威胁和挑战。结合目前国内外已有的研究成果和病例报道，对BI/NAP1/027型高产毒艰难拟梭菌的流行病学特征、毒力与致病机制、分子诊断技术和治疗方式等进行归纳总结，并展望了领域内未来的研究热点和努力方向，并为日后更深入地解析其致病机制和更科学地拟定其防治方案提供了理论依据。

艰难拟梭菌能引起医院获得性抗菌药物相关性腹泻，是抗菌药物耐药紧急威胁之一。全球各地区流行菌株有所差异，欧美主要流行高毒力菌株RT027，中国最常见的是ST3、ST37和ST54菌株。全球不同区域艰难拟梭菌对抗菌药物的敏感性不同，大部分对甲硝唑和万古霉素仍然敏感，对喹诺酮类、克林霉素耐药率高，多重耐药菌常见。欧美常见的耐药菌株类型为RT027，中国为ST3、ST35、ST37和ST54型别。抗菌药物的管理和医院感染的控制是遏制艰难拟梭菌耐药、暴发流行的主要措施。

目的:对艰难拟梭菌630（Cd630）菌株和致病决定区基因座（PaLoc）敲除突变株（ΔPaLoc）进行转录组测序和分析，获得Cd630野生型菌株和ΔPaLoc基因的差异性表达谱，并测定野生型Cd630菌株和ΔPaLoc突变株的细胞毒力，为构建艰难拟梭菌全菌减毒疫苗奠定基础。方法:对Cd630菌株和ΔPaLoc敲除突变株进行转录组测序，接着对差异表达基因进行筛选，随后对差异基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。最后在非洲绿猴肾细胞（Vero）和人克隆结肠腺癌细胞株（Caco-2）中进行Cd630野生型菌株和ΔPaLoc敲除突变菌株的细胞毒性验证实验。结果:转录组数据表明ΔPaLoc突变株毒素基因 tcdA、 tcdB未转录。 CD630_36010、 CD630_020910、 CD630_02080和 cel等基因分别上调17.92、11.40、8.93和7.55倍；编码高丝氨酸脱氢酶的 hom2基因、孢子形成蛋白基因 CD630_15810、锌结合脱氢酶基因 CD630_23230、1-磷酸半乳糖醇 5-脱氢酶基因 CD630_23240分别下调为野生型的0.06、0.075、0.133和0.183倍。GO和KEGG富集分析结果表明，ΔPaLoc突变株差异转录基因主要富集于密度感应系统、ABC运输系统、双组分系统、磷酸转移酶（PTS）系统、糖代谢通路以及万古霉素耐药相关的通路等。细胞毒力实验结果表明野生型Cd630菌株对Vero细胞和Caco-2细胞具有毒力，ΔPaLoc突变株丧失对Vero细胞和Caco-2细胞的毒力。 结论:通过对Cd630和ΔPaLoc突变株进行转录测序，表明毒素基因未转录，其他差异性基因可为进一步研究ΔPaLoc突变株生理生化特征提供指引。细胞毒力实验表明，ΔPaLoc突变株丧失了对Vero细胞和Caco-2细胞的毒力，ΔPaLoc突变株为艰难拟梭菌全菌减毒疫苗的构建奠定了基础。

目的 评估难辨梭状芽胞杆菌感染(CDI)消化系统疾病患者肠道菌群变化,以期为临床诊治提供参考.方法 纳入东莞市人民医院于2020年6月-2023年6月收治的189例医院获得性腹泻消化疾病患者的资料,按照难辨梭状芽胞杆菌感染(CDI)阳性与阴性1∶2匹配分组(63例:126例),检验艰难梭菌分离物,进行临床培养,鉴定病原菌及药敏,对难辨菌分离株进行基因分型并与临床结果进行比较,使用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测肠道微生物组的细菌靶点.结果 189例消化疾病患者中检出51株艰难梭菌,其中23株为产毒菌株;18.3％(22/120)的皮肤和环境样本显示艰难梭菌定植阳性结果;低浓度的甲硝唑和万古霉素[最低抑菌浓度(MIC)90、0.5和1.2 mg/L]对所有产毒艰难梭菌均有抑制作用;此外,这些菌株对莫西沙星和克林霉素的耐药率最高(MIC 90、0.5和1.6 mg/L);消化疾病组患者与健康对照组菌种比较差异均有统计学意义(P＜0.05);且除双歧杆菌属、肠球菌外,CDI消化疾病组患者与非CDI消化疾病组患者菌种亦存在差异(P＜0.05);CDI消化疾病组患者厚壁菌门载量高于非CDI消化疾病组(P＜0.05),而非CDI消化疾病组高于健康对照组(P＜0.05);就拟杆菌门载量而言,健康对照组＞非CDI消化疾病组＞CDI消化疾病组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 尽管消化系统疾病重症监护病房采取了适当的感染控制策略,但CDI在严重消化疾病患者中仍然很普遍.CDI消化疾病患者中黏液弧菌过度生长和普氏金黄色葡萄球菌丰度降低可能是消化疾病患者潜在的微生物组生物标志物.

目的:宏基因测序分析结直肠癌小鼠肠道菌群变化与巨噬细胞极化的相关性.方法:将3周龄APCmin/+小鼠和野生型C57/6J小鼠分成结直肠癌组(CRC组,n=8)和正常对照组(NC组,n=7),高脂饮食喂养8周收集粪便宏基因测序分析肠道菌群变化,免疫组化(IHC)检测肿瘤组织M2巨噬细胞极化.结果:HE病理显示CRC组小鼠造模成功,肿瘤数量显著多于NC组(P＜0.05).α多样性显示CRC组菌群多样性高于NC组,菌群丰富度无显著差异;β多样性显示两组间菌群明显分离.Venn图显示两组间共有物种1620种,NC组和CRC组特有物种分别为109、191种,门水平上两组间以厚壁菌门(74.04％vs 87.56％)和拟杆菌门(20.33％vs 6.42％)为主;种水平 Metastats 分析显示艰难梭菌(Clostridioides difficile_A)、弗雷特肯氏菌(Duncaniella freteri)、粪副拟杆菌(Parabacteroides merdae)、内脏拟杆菌(Odoribacter splanchnicus)在两组间具有显著差异(P＜0.05);KEGG功能分析显示CRC组核糖体、糖酵解及糖原生成、氧化磷酸化等通路显著富集;NC组神经活性配体受体相互作用、人类T细胞白血病病毒感染、胆固醇代谢通路显著富集;IHC分析显示CRC组M2巨噬细胞CD206含量高于NC组,Pearson相关性分析显示CRC组内脏拟杆菌丰度与CD206呈正相关(r=0.7799).结论:CRC小鼠肠道菌群发生显著变化并存在功能差异,不同差异菌群与巨噬细胞极化可能存在一定的相关性.

目的 建立针对水样中产气荚膜梭菌检测的TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,并测试该方法在自来水样中的检测效果.方法 选择位于该菌拟核中高度保守的plc基因,设计特异性引物和TaqMan 探针,经优化后建立了针对该菌的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,结合滤膜法处理含有plc基因的标准菌株的模拟污染水样,并对所建立的方法进行测试.结果 所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有高度的特异性,13株食源性致病菌、3株艰难梭菌及1株腐败梭菌的Ct值大于40;该方法的最低检出限为1× 10copies/μL,具有较高的灵敏性;对模拟污染水样的最低检测限为1.0×102 CFU/mL.应用该方法对4份人工模拟污染阳性水样与90份自来水样进行检测发现,2份1.0×102CFU/mL的模拟污染水样可检出产气荚膜梭菌,2份1.0×10CFU/mL的模拟污染水样与90份自来水样均未检出产气荚膜梭菌.结论 所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏性高的优点,对水体中产气荚膜梭菌的检测具有较高的应用价值.

目的 原核表达具有甲基化酶活性的艰难拟梭菌CamA(Clostridiodies difficile adenine methltransferase A,CamA)蛋白.方法 PCR扩增艰难拟梭菌1870标准菌株CamA蛋白的基因序列,克隆至质粒pGEX-4T-l-MBP中,转化至大肠埃希菌HB101,经1 mmol/L IPTG诱导表达重组目的蛋白,利用Amylose Resin纯化后,CamA蛋白再经烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶酶切,采用体外MTase-GloTM Methyltransferase Assay分析技术验证其甲基化活性.结果 PCR测序结果显示克隆的CamA基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pGEX-4T-1-MBP-CamA经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后显示1 731 bp的CamA基因已连接至载体上;表达的重组蛋白相对分子质量约为108 800(含1个MBP标签),经Amylose Resin纯化后,纯度达90％以上;在20 μmol/L DNA和20 μmol/L S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的条件下室温反应30 min,0.5 μg CamA能产生浓度约为101.60 nmol/L的S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine,SAH),酶活性为(0.339±0.027)U/mg.结论 成功表达并纯化了艰难拟梭菌CamA蛋白,其具有甲基化酶活性,为后续进一步研究CamA的功能及其在艰难拟梭菌感染发生、发展及治疗中的作用奠定了基础.

目的 评估黄连素对艰难梭菌相关性腹泻模型(CDAD)小鼠肠道菌群的调节作用.方法50只C57BL/6小鼠按照数字表法随机分为5组,每组10只.空白对照组不给予任何干预.余下4组小鼠经抗生素混合液预处理和克林霉素腹腔注射后给予艰难梭菌108CFU/L灌胃,建立抗生素诱导菌群失调致艰难梭菌相关性腹泻动物模型.造模组造模后不予药物治疗,黄连素组、万古霉素组、联合用药组分别给予黄连素100mg/(kg·d)、万古霉素50mg/(kg·d)及二者联合灌胃治疗.治疗结束后处死小鼠,取回盲部内容物进行Illumina Miseq PE300高通量测序检测菌群变化情况.结果CDAD小鼠模型肠道三大菌门的构成比(厚壁菌门48.52％,拟杆菌门0.19％,变形菌门51.29％,γ-变形菌纲成为优势细菌)与正常对照组(厚壁菌门55.55％、拟杆菌门35.13％、变形菌门8.81％,其中以δ-变形菌纲和ε-变形菌纲为主)相比发生显著改变.万古霉素组厚壁菌门9.72％,拟杆菌门64.00％,变形菌门26.10％,仍以γ-变形菌纲为主.黄连素组厚壁菌门21.95％,拟杆菌门70.72％,变形菌门3.36％,以δ-变形菌纲为优势菌.联合用药组厚壁菌门54.17％,拟杆菌门44.35％,变形菌门1.42％,δ-变形菌纲再次成为优势细菌.结论在艰难梭菌相关性腹泻小鼠模型中,黄连素可显著抑制多形菌门肠杆菌科细菌的繁殖,促进了小鼠肠道菌群的恢复,与万古霉素联合应用可减少万古霉素单独治疗的复发问题.

目的 分析厌氧菌标本来源、科室、年龄分布特征及药敏试验结果,为临床经验性治疗和合理使用抗菌药物提供依据.方法 收集2015年1月—2017年11月承德医学院附属医院住院患者所有合格标本中的厌氧菌,经VITEK2 compact ANC进行菌株鉴定,所有菌株使用头孢硝噻吩法检测β-内酰胺酶,使用浓度梯度药敏实验方法检测菌株对13种抗菌药物的敏感性.结果 分离出厌氧菌260株,其中,厌氧消化链球菌94株(36.15％)、脆弱拟杆菌81株(31.15％)、艰难梭菌42株(16.15％)、普雷沃菌属16株(6.15％)、产气荚膜梭菌11株(4.23％);除艰难梭菌标本来源为粪便外,其他厌氧菌主要分离自脓液;分离厌氧菌最多的科室为产科、老年病科及血液科.药敏结果显示,79株厌氧菌的β-内酰胺酶试验阳性,阳性率为30.4％;脆弱拟杆菌β-内酰胺酶87.6％为阳性,产酶率最高.厌氧消化链球菌对阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦100％敏感;脆弱拟杆菌对阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦敏感率100％;艰难梭菌对氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦敏感率100％;普雷沃菌属对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、替卡西林/克拉维酸敏感率100％;产气荚膜梭菌对青霉素、氨苄西林敏感率100％.甲硝唑对所有菌株均保持很高的敏感性.结论 厌氧菌引起的临床感染常见,不同厌氧菌的分布及药敏结果不尽相同,临床医生可根据菌株的分布特征及药敏结果对厌氧菌感染进行更有效的治疗.

目的 观察不同浓度理中汤多糖作为碳源对肠道拟杆菌及厚壁菌体外生长的影响.方法 提取高纯度理中汤总多糖.将两株典型肠道拟杆菌(多形拟杆菌ATCC29148和脆弱拟杆菌ATCC25285)及两株厚壁菌(梭菌C6和艰难梭菌SH186)分别分为多糖组、葡萄糖组、BHI组.多糖组中多形拟杆菌分别以含1％、5％、10％、20％、30％、40％的理中汤多糖培养基培养,脆弱拟杆菌分别以含1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％的理中汤多糖培养基培养;葡萄糖组以含葡萄糖的培养基培养;BHI组以含BHI的培养基培养.用连续取样和分光光度法测定OD值,再折算成细菌生长的浓度进行分析.结果 对于两株拟杆菌,最优多糖组细菌浓度最大值均高于BHI组,BHI组高于葡萄糖组,其中30％浓度多糖组的多形拟杆菌浓度最高,50％浓度多糖组的脆弱拟杆菌浓度最高(P均<0.05).对于两组厚壁菌,BHI组的梭菌浓度高于多糖组和葡萄糖组;仅BHI组的艰难梭菌有生长,而葡萄糖组和多糖组的艰难梭菌未见生长.结论 不同浓度的理中汤多糖均能影响典型拟杆菌的体外生长,相对于BHI和葡萄糖碳源的影响,理中汤多糖是一种适合拟杆菌生长的优势碳源,对于多形拟杆菌和脆弱拟杆菌体外生长的最优浓度分别为30％和50％;但理中汤多糖对厚壁菌的生长促进作用不明显,甚至有抑制作用.