尘螨-食物过敏综合征是由于进食与尘螨存在交叉抗原的食物(例如虾等)出现的速发型超敏反应,目前国内外均有报道尘螨与食物之间存在交叉反应,主要交叉抗原为原肌球蛋白.尘螨-食物过敏综合征患者的过敏症状轻重不一,原肌球蛋白致敏对尘螨过敏患者在进食虾等食物时应格外注意,以防发生难以预料的过敏事件.

目的 研究白术内酯Ⅰ对白塞氏病小鼠脾脏辅助性T细胞(T helper cell,Th)17/调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)平衡的影响.方法 将 40 只小鼠随机分为对照组,模型组,白术内酯I组,Jagged 1 组,每组各 10 只,其中除对照组外,其余组均采用虾原肌球蛋白致敏建立白塞氏病模型.采用Western blot法检测小鼠脾脏中Notch1 和Hes1 的表达水平及Th17 关键调控因子维甲酸相关孤儿受体(retinoic acid-related orphan receptor,ROR)γt和叉头框(forkhead box,Fox)p3 的表达;采用流式细胞术检测小鼠脾脏中Th17 和Treg的含量;采用ELISA法分别检测各组小鼠脾脏中Th17 细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-17、IL-22 的水平及Treg细胞因子IL-4和IL-10 的水平;TUNEL法检测脾脏细胞凋亡;免疫组化法检测小鼠脾脏半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3 的表达.结果 与对照组比较,模型组Th17 细胞比例、Notch1、Hes1、IL-17、IL-22、RORγt 和caspase-3 水平以及TUNEL阳性细胞数升高,Treg细胞比例、IL-4、IL-10 和Foxp3 水平降低(P＜0.05);与模型组比较,白术内酯Ⅰ组中Th17 细胞比例、Notch1、Hes1、IL-17、IL-22、RORγt和caspase-3水平以及TUNEL阳性细胞数降低,Treg细胞比例、IL-4、IL-10 和Foxp3 水平升高(P＜0.05);与白术内酯Ⅰ组比较,Jagged 1 组Th17 细胞比例、Notch1、Hes1、IL-17、IL-22、RORγt 和caspase-3水平及TUNEL阳性细胞数升高,Treg细胞比例、IL-4、IL-10 和Foxp3 水平均降低(P＜0.05).结论 白术内酯Ⅰ能够改善原肌球蛋白诱导的白塞氏病小鼠脾脏Th17/Treg细胞比例失调,降低白塞氏病小鼠脾脏细胞的凋亡.

目的 探讨双黄连注射液(SHLI)对Ⅰ型超敏反应性炎症的作用.方法 以抗虾原肌球蛋白(ST)多抗血清致敏大鼠嗜碱性粒细胞性白血病细胞RBL-2H3,次日加入SHLI 0.5％～2.0％孵育30 min,再以ST攻击诱导其脱颗粒,荧光法检测上清β-氨基己糖苷酶含量;以佛波酯(PMA)/A23187刺激人外周血嗜碱性白血病细胞KU812,用ELISA测定其分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和前列腺素E2(PGE2)等炎症介质的水平;建立抗ST多抗血清和ST诱导的小鼠Ⅰ型超敏反应足肿胀模型,观察ip给予0.5％,1.0％和2.0％SHLI 3 d对ST攻击后1 h(速发相)和24 h(迟发相)小鼠足容积的影响.结果 与模型组比较,0.5％,1.0％和2.0％SHLI均明显抑制ST所致RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶的释放,荧光值分别下降16％,31％和51％(P<0.01),并显著减少PMA/A23187诱导的KU812细胞上清中炎症介质TNF-α,IL-6和PGE2的含量,TNF-α分别降低35％,55％和69％(P<0.01),IL-6分别降低29％,51％和74％(P<0.01),PGE2分别降低31％,40％和55％(P<0.01).体内实验结果显示,速发相时SHLI 2.5和5.0 mL·kg-1使足容积差分别降低69％和83％(P<0.01),迟发相时分别降低70％和100％(P<0.05,P<0.01).结论 SHLI可抑制Ⅰ型超敏反应性炎症.

目的:以南美白对虾中主要过敏原原肌球蛋白(TM)为研究对象,研究TM在体外模拟胃液(SGF)消化中表位的变化情况.方法:SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA用于分析TM在SGF中的消化情况以及免疫活性和过敏原性的变化,并采用质谱方法分析TM抗原表位的变化.结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示,随着消化时间的增加,TM条带逐渐变浅,但是在2 h时仍具有免疫活性.间接ELISA结果显示,消化2 h后,TM的免疫活性及过敏原性分别下降89.1％和80.8％.质谱结果表明,TM在胃液消化过程中大部分抗原表位会被破坏,但是TM在胃液中消化2 h时仍具有免疫活性和过敏原性,很可能是因为消化片段中存在有3个不被破坏的抗原表位(肽段111～125、137～141和153～161)和4个抗消化能力很强的抗原表位(肽段50～66、144～151、145～164和150～163)所致.结论:本研究可为今后探讨人体消化对TM过敏原性的影响机理及脱敏或低致敏性食品的开发提供科学依据.

目的:探讨三物黄芩汤对白塞病(BD)模型小鼠IFN-γ、IL-17A水平的影响.方法:收集临床样本并分离单个核细胞,采用RNA-seq高通量测序并鉴别白塞病与健康受试者的差异基因.通过虾原肌球蛋白致敏构建BD小鼠模型并给予三物黄芩汤浓缩液灌胃治疗,ELISA和流式细胞术检测外周血和单个核细胞中IFN-γ、IL-17A的水平,RT-PCR法检测脾脏组织中TBX21基因的表达水平.结果:与健康受试者相比,BD患者共有31个差异基因,其中19个基因表达上调,12个基因表达下调.PPI分析结果显示差异基因中排名前5的基因分别为TBX21、STAT3、IL15、PRF1和IFNG.动物实验结果表明,与空白组相比,模型组外周血及PBMC中IFN-γ、IL-17A的水平明显增高(P<0.01),三物黄芩汤能明显降低小鼠外周血及PBMC中IFN-γ、IL-17A的水平(P<0.05).RT-PCR结果显示,与空白组相比,模型组脾脏组织中TBX21 mRNA的表达水平明显增高,(P<0.01).三物黄芩汤能降低小鼠脾脏组织中TBX21 mRNA的表达水平(P<0.05).结论:三物黄芩汤通过靶向抑制TBX21 mRNA的表达水平,进而抑制INF-γ和IL-17的水平,达到治疗BD的作用.

目的:在大肠杆菌中重组表达贝类主要过敏原—原肌球蛋白(Pen a 1),并且评估其IgE结合活性.方法:首先基于Pen a 1的已知序列人工合成Pen a 1基因,其次将其与质粒pET-28a连接以构建重组表达质粒pET-28a(+)-Pen a 1,经测序、酶切鉴定后导入表达宿主E.coli BL21 (DE3)细胞中.通过IPTG诱导,重组表达Pen a 1蛋白,镍柱纯化表达产物,并采用SDS-PAGE电泳及质谱技术鉴定所得重组蛋白.最后应用贝类过敏患者采用LICA技术检测该重组蛋白的IgE结合活性.结果:PCR结果表明,目的基因全长为930 bp,与理论预测值一致.SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白在宿主菌内以可溶性蛋白的形式高效表达,分子量约为36 kD,大小与理论值相符.质谱鉴定结果进一步说明所得的重组蛋白为原肌球蛋白Pen a 1.免疫分析结果表明该蛋白具有较高的IgE结合能力.结论:成功表达、纯化出有良好免疫学活性的重组原肌球蛋白Pen a 1,为进一步研究Pena1在贝类动物如虾类过敏的诊断和治疗中作用奠定基础.

目的 建立超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱法,分析沼虾中的过敏原蛋白.方法 基于Bottomup(自下而上)蛋白分析策略,采用Tris-HCl提取罗氏沼虾样品中的目标蛋白,胰蛋白酶40 ℃C消化6h,肽段经过色谱分离后采用四极杆静电场轨道离子阱质谱(Full MS/dd-MS2监测模式,TopN=10)测定,利用UniProt蛋白数据库和Proteome Discoverer软件鉴定过敏原蛋白.结果 获得4种过敏原蛋白,分别为原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌浆钙结合蛋白和血蓝蛋白,肽段覆盖率分别为53％、36％、12％和12％,翻译后修饰的位点有天冬氨酸(D)的甲基化,天冬酰氨(N)和谷氨酰氨(Q)的脱酰氨化以及蛋氨酸(M)的氧化.结论 超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱能获得丰富的肽段及碎片信息,灵敏度和分辨率较高,可用于虾及虾制品的过敏原蛋白鉴定和分析.

目的:通过研究中药制剂三物黄芩汤对白塞氏病小鼠外周血中炎症因子IFN-γ 及P-STAT3蛋白表达的影响,探讨三物黄芩汤的疗效机制.方法:BALB/c小鼠60只,分为空白组、模型组、沙利度胺组、三物黄芩汤组,每组10只.采用对虾原肌球蛋白过敏原,建立小鼠白塞氏病模型,采用ELISA方法检测小鼠外周血IFN-γ的水平变化,采用Western Blot检测小鼠脾脏相关蛋白P-STAT3含量.结果:与空白组小鼠比较,模型组的炎症因子水平及P-STAT3蛋白含量明显升高(P<0.01),表明白塞氏病小鼠的炎症因子水平及P-STAT3蛋白含量显著升高.给予沙利度胺、三物黄芩汤后,与模型组相比小鼠的炎症因子水平及P-STAT3蛋白含量明显降低(P<0.01或P<0.05),但沙利度胺组与中药高剂量组之间小鼠的炎症因子及P-STAT3蛋白含量水平无显著差异(P>0.05).结论:三物黄芩汤可降低白塞氏病小鼠炎症因子水平及P-STAT3蛋白的表达.

目的 优化虾过敏原蛋白质谱分析试验的胰蛋白酶酶解条件,提高质谱对虾过敏原蛋白的分析能力.方法 采用响应面试验设计对虾过敏原蛋白酶酶解的pH值、温度和时间进行优化,用胰蛋白酶消化肽段,经色谱分离后采用四极杆静电场轨道离子阱高分辨质谱测定,利用UniProt蛋白数据库和MaxQuant软件对过敏原蛋白进行鉴定和定量分析.结果 获得虾中2种过敏原蛋白,分别为原肌球蛋白和精氨酸激酶,质谱强度为100.2×106～436.5×106.响应面分析结果显示,酶解时间为4.29 h、温度为44.15℃、溶液pH值为6.55时,过敏原蛋白的质谱响应强度最高,为457.48×106.采用溶液pH值6.5、温度44℃、时间4.2 h进行验证试验,获得过敏原蛋白的平均响应强度为448.1×106,与预测值偏差为2.1％.结论 采用响应面法可以优化蛋白酶酶解条件,当pH值为6.5、温度为44 ℃、时间为4.2 h时具有最佳的酶解能力.

目的 探究绿原酸(CA)对虾过敏原原肌球蛋白(TM)结构和潜在致敏性的影响,以消减虾过敏原致敏性,为控制虾类过敏风险提供理论支持.方法 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、内源荧光、圆二色谱分析CA和TM形成共价结合复合物结构的变化,酶联免疫印记和KU812细胞分析共价复合物潜在致敏性的变化.结果 不同浓度的CA与虾TM相互作用后,随着CA浓度的增加,条带轻微上移,分子量增加,形成共价复合物.2.0 mg/mL CA与TM共价结合后,游离氨基的含量降低了46.01％,有效赖氨酸含量降低了32.10％,表面疏水性下降36.36％,内源荧光强度降低了68.49％,α-螺旋含量下降了41.12％.TM的IgE结合能力下降32.56％,β-已糖苷酶和组胺含量分别下降了37.70％和23.46％,白介素-4和白介素-13也显示同样的下降趋势.结论 CA共价结合能改变TM的结构,从而降低其潜在致敏性.