目的:从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor)肝脏组织中克隆细胞色素P450还原酶基因(BgCPR,GenBank登录号:OQ572435)进行生物信息学分析,并进行功能验证.方法:基于中华大蟾蜍转录组数据库挖掘BgCPR基因序列,使用SnapGene软件设计BgCPR基因两端特异性引物,以蟾蜍肝脏组织总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增.利用生物信息学分析BgCPR蛋白理化性质、空间结构并构建系统进化树;基于CRISPR/Cas9基因编辑系统将蟾蜍BgCPR基因表达框经同源重组整合进入酿酒酵母基因组,利用聚乙二醇法制备转化子微粒体,验证其对细胞色素C的还原功能.结果:克隆得到全长2 043 bp的BgCPR基因cDNA,编码680个氨基酸,相对分子质量77 852 Da.结构预测显示,BgCPR蛋白为非分泌蛋白;有一段跨膜螺旋区,位于蛋白的第24～46位氨基酸之间;亚细胞定位预测显示该蛋白定位于内质网上.采用体外酶活实验证明其具有传递电子功能.结论:本研究克隆得到中华大蟾蜍BgCPR基因,并构建了表达具有生物活性的BgCPR的酿酒酵母工程细胞,为进一步研究蟾蜍CYP450基因功能乃至解析蟾蜍二烯内酯类化合物的生物合成途径奠定了基础.

目的 挖掘能催化蟾蜍内酯类化合物特异性羟化修饰的酶,以促进名贵中药材蟾酥功效组分的开发与应用.方法 采用同源序列比对挖掘藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)中的甾体羟化酶,通过毕赤酵母异源表达、工程菌株细胞转化以及代谢产物的分离与鉴定,从而确定酶的功能.结果 以蟾蜍内酯类化合物蟾毒它灵、蟾毒灵为底物,毕赤酵母重组菌株KM71H-FF294转化蟾毒它灵没有产生明显的产物,而转化蟾毒灵时产生了羟化产物7β-羟基蟾毒灵.结论 从藤仓赤霉菌中发现能催化蟾毒灵发生7β-羟化修饰的甾体羟化酶FF294,是目前文献报道首个能催化蟾蜍内酯类化合物羟基化反应的酶.

蟾酥为我国传统名贵中药,其化学成分复杂,具有广泛的药理活性.蟾酥的化学成分主要包括蟾蜍内酯类、吲哚类生物碱、甾醇类及其他类化合物.现代药理学研究表明,蟾酥具有抗肿瘤、强心、抗炎、局麻、镇痛等多种药理活性.对近年来蟾酥化学成分、药理活性及其人工合成等方面的研究进展进行综述,以期为蟾酥的物质基础研究、药效机制阐释及其开发利用提供参考.

目的:建立同时测定六神丸中6个蟾蜍二烯内酯类成分含量的一测多评法(QAMS),并验证其准确性和可行性.方法:采用高效液相色谱法,使用Waters Xbridge C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1 mL· min-1,柱温30℃,检测波长296 nm.以华蟾酥毒基为内参物,建立其与远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基5个成分的相对校正因子(RCF),并进行含量计算,实现一测多评;同时采用外标法(ESM)测定六神丸中蟾酥的6个成分的含量,比较一测多评法计算值与外标法实测值的差异.结果:在一定线性范围内,华蟾酥毒基与远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基的RCF值分别为0.897、0.965、1.023、0.844、0.964,且在不同实验条件下重现性良好(RSD＜5.0％),一测多评法测得15批样品中华蟾酥毒基、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基的含量范围分别为2.26～9.27 mg·g-1、0.95～2.06 mg·g-1、1.12～2.50 mg·g-1、1.83～3.48 mg·g-1、1.10～2.81mg· g-1、0.90～3.65 mg·g-1,与外标法实测值无显著性差异.结论:所建立的同时测定六神丸中的6个蟾蜍二烯内酯类化合物的一测多评法准确可靠,可用于六神丸中多个成分的定量分析质量评价.

目的 建立一测多评法同时测定心可宁胶囊中6种蟾蜍二烯内酯类化合物的含量,并验证此方法在心可宁胶囊中应用的可行性和准确性.方法 以华蟾酥毒基为内参物,建立日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基与华蟾酥毒基的相对校正因子.分别采用外标法和一测多评法测定心可宁胶囊中6种蟾蜍二烯内酯类化合物的含量,比较2种方法的结果差异,验证一测多评法的可行性和准确性.结果 日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基与华蟾酥毒基的相对校正因子分别为1.06,0.862,0.897,1.09,0.915;2种方法结果无显著差异.结论 以华蟾酥毒基为内参物建立的相对校正因子重现性好,一测多评法可用于心可宁胶囊中多个蟾蜍二烯内酯类成分的质量评价.

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufobufogargarizans或黑眶蟾蜍B.melanosticus的干燥全皮,己纳入壮药名录.作为一种民族药,常用于满族、回族和朝鲜族的民间药方,具有清热解毒和利水消肿之功效.目前己从蟾皮中发现100多个化合物,包括蟾蜍二烯羟酸内酯类、吲哚生物碱类、蟾蜍环酰胺类以及甾体类等成分.随着国内外药理学研究的不断深入,蟾皮单体成分呈现诸多药理作用,如抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗乙肝病毒、强心等,并且对特异的药物代谢酶具有较高的敏感性.通过查阅近20年来的国内外文献,对蟾皮的化学成分、药理活性、单体成分与药物代谢酶的相互作用等方面进行综述,以期为蟾皮更好的开发和应用提供参考.

目的 研究蟾皮(中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans的干燥皮)中的蟾蜍甾烯类成分及其细胞毒活性.方法 利用硅胶、ODS、凝胶、高效液相色谱等方法对中药蟾皮的化学成分进行分离,运用IR、UV、NMR、MS及单晶X-衍射等波谱学方法对分离得到的化合物进行结构鉴定,采用MTT法测试化合物对人肝癌HepG2细胞、人非小细胞肺癌A549细胞及人宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制活性.结果 从蟾皮95％乙醇提取物的氯仿萃取部位共分离鉴定了 14个蟾蜍甾烯类成分,分别为3,23-二羟基-γ-内酯-24-去甲-14,20(22)-二烯-21-胆酸(1)、3-表-酯蟾毒配基(2)、3-表-去乙酰华蟾蜍精(3)、3-表-蟾蜍灵(4)、3-氧-去乙酰华蟾蜍精(5)、3-氧-蟾蜍它灵(6)、3-氧-伪沙蟾蜍精(7)、3-oxo-Δ4(5)-resibufogenin(8)、3-oxo-Δ4(5)-cinobufotalin(9)、3-dehydroscillarenin(10)、3-氧-毛地黄毒苷配基(11)、digirezigenin(12)、bufogargarizin A(13)、bufogargarizin B(14).化合物6、9、10对HepG2、A549及HeLa细胞具有显著的增殖抑制活性,半数抑制浓度(IC5o)为0.11～1.67 μmol/L.结论 化合物1为新天然产物,并首次报道其核磁数据;化合物1～14均为首次从蟾皮中分离得到;化合物 6、9、10具有显著的细胞毒活性.

蟾酥为干燥的蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺或皮肤腺分泌物,有毒,且质地坚硬,具有解毒消肿、止痛的功效.蟾酥炮制历史悠久,早在宋代就有铁上焙焦的记载,除沿用至今的酒制、乳制、滑石粉烫制,古代还曾出现焙法、煅法、汤浸、醋化等炮制方法,蟾酥炮制加工后更易于粉碎,且能降低毒性.现代研究表明,蟾酥主要的化学成分包括蟾毒内酯类、吲哚类生物碱、甾醇类等化合物,具有抗肿瘤、强心、抑菌、抗炎、免疫调节等药理作用.该文从蟾酥的炮制历史沿革、化学成分及药理作用等方面进行论述,以期为蟾酥的特色饮片炮制及现代研究提供参考,并为其炮制机制及质量控制研究提供理论依据.

蟾蜍二烯酸内酯类化合物是名贵中药蟾酥的主要活性成分,具有显著的抗肿瘤、强心、镇痛和抗炎等药理活性.目前,蟾蜍二烯酸内酯成分的主要来源方法是从蟾蜍类药材中直接提取,但此方法成本高、收益低,且药用资源十分短缺,相关新药开发与应用研究严重受阻.近年来,中药活性成分的生物合成在中药资源保护方面发挥起越来越重要的作用.基于合成生物学原理,设计和改造微生物菌株发酵生产天然产物的方法已被广泛使用.该方法的应用需要建立在目标产物生物合成途径完全解析的基础之上.基于此,总结近年来蟾蜍二烯酸内酯的生物转化以及生物合成途径解析方面的研究进展,并进一步推测蟾蜍二烯酸内酯类的生物合成途径,并进一步展望与其相关的生物合成发展方向.

目的:研究蟾酥中的蟾蜍二烯羟酸内酯类成分.方法:用95％乙醇提取蟾酥,利用硅胶柱、Saphadex LH-20葡聚糖凝胶、HPLC等柱色谱方法进行化合物的分离纯化.根据化合物的理化性质以及MS、NMR等波谱数据进行结构鉴定.结果:从蟾酥95％乙醇提取物中共分离鉴定了12个化合物,分别为:异沙蟾毒精-3-辛二酸单酯(1)、沙蟾毒精-3-辛二酸单酯(2)、华蟾酥毒基(3)、沙蟾毒精(4)、异沙蟾毒精(5)、嚏根草醇(6)、12β-羟基蟾毒灵(7)、脂蟾毒配基(8)、去乙酰华蟾毒它灵(9)、蟾毒它灵(10)、华蟾毒它灵(11)、蟾毒灵(12).结论:其中,化合物1为新化合物,化合物2为首次从中华大蟾蜍中分离得到.