目的:探讨克尔斯滕大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)突变亚型对非小细胞肺癌细胞程序性细胞死亡配体1(PD-L1)和2(PD-L2)的表达影响。方法:纳入2018年1月至2021年1月甘肃省肿瘤医院收治的KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例，通过测序检测KRAS基因组序列，通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹检测PD-L1和PD-L2的表达。使用成簇的规则间隔的短回文重复基因编辑(CRISPR/CAS9)技术构建KRAS缺失型A549细胞，在敲除株中过表达KRAS野生型和突变型，检测其对PD-L1和PD-L2的表达影响。将KRAS野生型和突变型过表达的KRAS敲除人肺泡上皮细胞549(A549)细胞株与树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)，通过流式细胞术检测群集行列式蛋白3阳性(CD3 +)细胞的凋亡水平。使用 t检验比较连续变量。使用Mann-Whitney检验分析KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2。Chi-square检验分析非小细胞肺癌患者KRAS突变型和KRAS野生型的临床特征。 结果:纳入KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例，KRAS野生型31例、KRAS突变型64例；其中KRAS第12位甘氨酸突变为天冬氨酸(G12D)13例、突变为缬氨酸(G12V)12例、突变为半胱氨酸(G12C)25例、突变为丙氨酸(G12A)14例。KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2的mRNA表达水平(1.062比1.834， U＝38；1.062比1.668， U＝70；1.062比1.544， U＝111；1.062比1.479， U＝89， P<0.05；1.067比1.798， U＝68；1.067比1.595， U＝86；1.067比1.527， U＝171；1.067比1.680， U＝34， P<0.05)和蛋白表达水平均高于KRAS野生型患者，差异有统计学意义。在KRAS敲除A549细胞株中，相较于KRAS野生型，KRAS突变型更能够促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达同时，将KRAS-G12D，KRAS-G12V，KRAS-G12C，KRAS-G12A质粒混合在一起作为RAS野生型(KRAS-MT)与KRAS突变型(KRAS-WT)分别转染KRAS敲除A549细胞株，KRAS-MT依旧可以促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达。在KRAS敲除A549细胞株中过表达KRAS-MT与KRAS-WT后，KRAS突变亚型不能激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路，但是可以激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路。AKT抑制剂处理后，KRAS-MT与KRAS-WT转染KRAS敲除A549细胞株的PD-L1和PD-L2的表达差异无统计学意义。将转染了KRAS-MT或KRAS-WT的KRAS KO A549细胞株与DC-CIK以1∶1的比例共培养，随后检测DC-CIK细胞的凋亡水平，发现KRAS-MT能够显著增加DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡( F＝12.5， P<0.05)，差异有统计学意义。 结论:KRAS突变亚型能够显著增强非小细胞肺癌细胞PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达，并且能够促进免疫细胞DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡。

宫颈癌是世界上女性癌症排名第4位的恶性肿瘤，严重威胁女性的健康。宫颈癌患者的主要治疗方案为手术或同步放化疗，随着医学研究的发展，研究者们致力于探究更为有效、特异的治疗方案，以期增加宫颈癌的治疗策略和提高治疗效果。簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）技术是Cas9蛋白利用向导RNA（gRNA）的引导进而靶向目标基因，实现对目标基因精准编辑的方法。目前，CRISPR/Cas9技术已成为一种很有前途的强大基因编辑工具，是一种新的有效的靶向治疗方法，且被应用于多种肿瘤的治疗中。主要从作用靶点、联合治疗策略以及相关耐药基因筛选等方面对CRISPR/Cas9技术在宫颈癌治疗中的研究进展进行综述，以期为宫颈癌的治疗提供新的策略。

快速准确的分子诊断在食品安全、疾病诊断、环境监测等生命科学领域发挥重要作用.成簇规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR/Cas系统因具有高灵敏度、高特异性、便捷性及快速等优势,已成为精确检测核酸靶标的重要分子诊断工具.基于CRISPR/Cas系统的检测通过预扩增步骤提高靶标浓度,但也随之带来气溶胶污染、操作复杂和检测周期长等问题.因此需要积极开发更多免扩增策略,在最大限度保证灵敏度的同时,一步式实现对靶标的检测.综述了免扩增CRISPR系统的重要性,重点阐述了反应影响因素及相关策略对体系的优化作用,以及数字芯片法、表面增强拉曼光谱法和电化学金属电极法对信号放大效果的前沿进展,并对CRISPR/Cas系统的即时检测应用进行展望,以期为免扩增CRISPR/Cas检测系统的发展提供理论指导.

目的 建立一种灵敏、特异的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-规则成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的日本血吸虫核酸检测方法.方法 以日本血吸虫SjR2基因片段作为靶序列,设计LAMP引物、gRNA和ssDNA探针,建立并优化LAMP-CRISPR反应体系.用LAMP-CRISPR方法检测含有SjR2靶序列的10倍梯度稀释的重组质粒,不同发育阶段日本血吸虫基因组DNA,以及肝片形吸虫、曼氏血吸虫、肥胖带绦虫、华支睾吸虫、似蚓蛔线虫、美洲钩口线虫、卫氏并殖吸虫、细粒棘球绦虫等蠕虫基因组DNA,评价其灵敏度和特异度.用LAMP-CRISPR方法分别检测15份血吸虫感染的阳性钉螺样本以及30份未感染的阴性钉螺样本,并与LAMP检测结果比较,以评价LAMP-CRISPR方法用于筛查感染性钉螺的应用效果.结果 建立的基于LAMP-CRISPR的核酸检测方法可特异性扩增并检测出日本血吸虫目的基因片段.其最适反应温度为37℃,反应体系中gRNA的最佳反应浓度为40 nmol/L,Cas12a蛋白的最佳反应浓度为40 nmol/L.该方法与肝片形吸虫等蠕虫基因组DNA均无交叉反应;以 10 倍梯度稀释的重组质粒为模板,该方法检测限为10拷贝/μL;此外,该方法能够准确检测出日本血吸虫虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、童虫及成虫基因组DNA.45份钉螺样本检测结果显示,LAMP-CRISPR与LAMP检测感染性钉螺的结果差异无统计学意义(χ2=0.05,P>0.05);与金标准比较,LAMP-CRISPR方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为96.67%(29/30),LAMP方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为93.33%(28/30).结论 本研究建立了一种灵敏性和特异性均较高的基于LAMP-CRISPR的日本血吸虫核酸检测方法,具有用于日本血吸虫感染快速检测及风险监测的潜力.

背景:CRISPR/Cas9基因编辑系统来源于由成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白(Cas)介导的细菌适应性免疫系统.造血干细胞具有易分离、自我更新分化能力强的优势,已成功应用于恶性血液病、严重的自身免疫性疾病等领域.采用 CRISPR/Cas9 系统对造血干细胞进行体内、体外编辑,是提高造血干细胞移植治疗水平的研究趋势,在临床上具有很大潜力.目的:综述 CRISPR/Cas9 系统在造血干细胞移植领域中的疾病治疗、递送方式、编辑功能优化以及临床应用等方面的最新研究进展.方法:以"造血干细胞,CRISPR/Cas9,基因编辑,递送;stem cells,CRISPR/Cas9,gene editing,delivery"为关键词,检索CNKI、PubMed数据库、相关临床试验及公司在研产品中2012至2018年的文献,初步筛选后,对保留的61篇文献进行详细研究、归纳和总结.结果与结论:利用 CRISPR/Cas9 简易高效的基因编辑能力以及造血干细胞自我更新和分化的能力,编辑过的造血干细胞可以在血液和免疫系统中实现整个造血系统的终身修复重建,在疾病治疗方面具有很大的潜力.CRISPR/Cas9的递送方式目前仍存在局限,需要对其进一步研究和优化,此外,该系统在造血干细胞领域的临床研究及其需应对的伦理和安全问题也需要考虑.

目的 探索聚簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统对于食蟹猴细胞及胚胎基因组视网膜母细胞瘤抑癌基因(Rb1)的编辑效率,旨在进一步建立视网膜母细胞瘤模型.方法 查阅RB1突变数据库(http://rb1-lsdb.d-lohmann.de),确定视母细胞瘤发生发展相关Rb1基因外显子区主要有8号外显子;利用DNAman检测人类与食蟹猴基因组中Rb1基因中与是否存在单核苷酸多态性(SNP);通过http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html设计并合成sgRNA;采用CRISPR/Cas9基因编辑系统转染食蟹猴成纤维细胞,并提取转染后细胞基因组以检测合成的sgRNA敲除效率;酶切实验检测转染的细胞是否发生突变,并利用单克隆分析测定具体敲除效率.进一步利用显微操作技术注射sgRNA和Cas9 nuclease混合物(RNP)入单细胞胚胎,检测胚胎水平Rb1基因编辑效率.结果 RNP转染后的食蟹猴成纤维细胞提取基因组检测,发现其中有75％的细胞发生基因突变,且基因编辑类型多样,以碱基缺失突变为主;在胚胎水平上获取4-细胞期胚胎,检测单个卵裂球基因组序列发现,存在突变的胚胎占所有胚胎的36.4％,其中纯合突变比例为18.2％,嵌合突变比例同为18.2％.利用软件预测脱靶位点12个,进行序列测定,结果未发现脱靶.结论 在非人灵长类细胞及胚胎水平上,CRISPR/Cas9基因编辑系统对于食蟹猴Rb1基因编辑有效,并且敲除效率较高,进一步利用基因编辑方法建立视网膜母细胞瘤模型研究中,可以作为有效的基因编辑手段.本研究得到的食蟹猴胚胎Rb1基因的编辑效率及胚胎囊胚率为建立视网膜母细胞瘤模型提供了参考.

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是由于G6PD基因突变引起的X连锁最常见的血液系统遗传疾病,目前的治疗以预防为主,严重者采用对症治疗.在基因水平上修复其突变位点将极大地改善这一现状,具有较好的应用前景.最新的基因编辑技术,即成簇规则间隔短回文重复序列及相关蛋白9 (CRISPR/Cas9)可通过同源性指导的修复来修正突变基因.这项技术正在体外应用于人类诱导多能干细胞(iPSCs)中,以纠正多种严重的遗传疾病,但目前鲜见用于G6PD缺乏症的治疗研究.本文重点介绍新型基因编辑技术CRISPR/Cas9治疗G6PD缺乏症的可行性和运用前景.

基于干细胞的细胞疗法是目前最有潜力和创新性的方法,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)结合成体干细胞和胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)的优点和特征,在重编辑技术方面取得了重大进展.本文介绍了iPSC技术和位点特异性核酸酶(site specific nucleotide,SSN)介导的基因编辑工具的发展,以及这两种新技术在生物医学研究和治疗试验中的联合应用.iPSC在体外的多能特性不仅为基础研究提供了无限的细胞来源,而且还有益于人类疾病治疗药物的筛选.此外,随着基因组编辑技术的发展,通过使用核酸酶,如锌指核酸酶(zincfinger nuclease,ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN),以及成簇的、规则间隔短的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas系统来纠正基因突变导致的疾病,以便于逆转体细胞突变引起的疾病.将iPSC和SSN技术联合起来创建具有体外同基因背景的新的可靠的人类疾病模型,为精确的细胞替代治疗提供新的解决方案.

规则成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)系统是存在于大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫系统.作为一种高效的基因定点编辑工具,CRISPR/Cas系统不仅在基因敲出、基因治疗及基因修饰等领域炙手可热,而且正在发展成为核酸精准检测领域的新利器.随着众多研究者的不断探索,便携、快速、低成本、灵敏度高、特异性强的CRISPR/Cas核酸精准检测技术不断涌现.本文就CRISPR/Cas技术在核酸快速精准检测领域的最新成果作一概述,并总结展望其面临的困难和挑战.

建立快速、灵敏、特异的核酸分析方法,对于精准的疾病诊断和有效的临床治疗具有重要意义.规则成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)系统被认为是具有广泛医学应用潜力的通用型基因组编辑工具.近几年,由于CRISPR/Cas系统高度的灵活性、敏感性和特异性而被开发用于病原体检测、肿瘤早期诊断、单核苷酸多态性(SNP)分析等.本文概括介绍了CRISPR/Cas系统核酸检测技术及其应用进展.